1、红外、拉曼色谱在蛋白质二级结构测定中的作用,拉曼散射光谱的基本概念,一束频率为V0的入射光，照射到气体液体或透明晶体样品上，绝大部分可以透过，大约有0.1%的入射光光子与分子发生碰撞后向各个方向散射。有一部分散射光发生了光子与分子之间的能量交换，即非弹性碰撞，散射的频率不再等于V0，而是Vi，这种散射现象称为拉曼散射。根据这个原理所获得的散射光谱，称为拉曼光谱。,若入射光与基态分子相碰撞而发生拉曼散射，分子从光子那里获得能量，从振动基态跃迁到振动的激发态，而散射光子的能量减小，散射光的频率低于入射光的频率，这种形式的拉曼散射称为Stokes辐射，相应的光谱线称为Stokes线。如果与入射光相碰
2、撞的分子是处于振动的激发态，结果分子交出能量给光子，散射光子的能量增强，散射光的频率大于入射光的频率，这种形式的拉曼散射称为反-Stokes辐射，相应的谱线为反-Stokes线。,在振动光谱中有九个谱峰，按 波数递减的方向命名为酰胺A、B及酰胺I至VII带，各种酰胺(Amide)频率：在3000cm-1以上，有酰胺A（3280cm-1）及酰胺B（3090cm-1 ） ；在1700cm-1以下有酰胺（1650cm-1）酰胺(1550cm-1)酰胺(13001250cm-1)酰胺(627cm-1)酰胺(725cm-1)酰胺(600cm-1)及酰胺(206cm-1)。,拉曼散射光谱的应用,酰胺A 3
3、280cm-1 酰胺B 3090cm-1 酰胺 1650cm-1 酰胺 1550cm-1 酰胺 13001250cm-1,C=O伸缩、CN伸缩和NH面内弯曲振动,NH面内变形及CN伸缩振动,CH伸缩振动,振动谱带 振动波数 归属,N-H伸缩 N-H伸缩（费米共振）,酰胺 627cm-1 O=CN面内弯曲振动 酰胺 725cm-1 NH面外弯曲 酰胺 600cm-1 C=O面外弯曲 酰胺 206cm-1 CN扭曲振动,振动谱带 振动波数 归属,此外，还有可能存在CCH3伸缩振动频率（910890cm-1）以及骨架振动频率（500cm-1以下）。,酰胺I带各子峰所对应的二级结构：,Table2 F
4、T-Raman frequencies of protein amide I bands and their assignments to different secondary structure,此外，Lippert等人用已知二级结构的蛋白质（聚-L-赖氨酸）的拉曼光谱得到一组强度参数，然后用蛋白质拉曼光谱的酰胺III和酰胺I（重水溶液）谱带强度建立了一组联立方程，从而求解蛋白质的二级结构。,根据Lippert等的方法，以聚-L-赖氨酸的三种构象为模型，利用四阶联立方程组：,聚-L-赖氨酸三种构象的酰胺谱带（1240，1632，1660）对CH21448cm-1模式的相对强度数据,水溶液
5、重水溶液,1240 1632 1660 聚-L-赖氨酸，-螺旋 0.00 0.80 0.55 聚-L-赖氨酸， -折叠 1.20 0.72 0.88 聚-L-赖氨酸，无序 0.60 0.08 0.78,注：这些数据是Lippert等的修正值,另外，在多肽和蛋白质的拉曼光谱中，谱带850和830是酪氨酸残基的对未取代基的有关振动。由于环的呼吸振动和面外弯曲振动倍频之间的费米共振，它们总是成双成对的出现，而且这两谱带的强度比可表征酪氨酸残基所处的环境，并定量的表示它呈“暴露式”或“埋入式”。 0.5Nbury+1.25Nexpo=I850/I830 Nbury + Nexpo = 1,红外光谱的应
6、用,蛋白质主要表现出九个吸收谱带，其中酰胺I（16001700cm-1）是C=O伸缩、CN伸缩和 NH面内弯曲振动的贡献，对蛋白质二级结构的研究最有价值，其振动频率受C=O和NH之间氢键的影响，通过这个可以测定氨基酸链的二级结构。 酰胺I带的归属：,16501658 -螺旋 1640 1610 -折叠 1700 1660 -转角 1650 1640 无规卷曲,但是H2O在1640附近的吸收对其造成很大影响，目前可以采用吹扫，差减及氘代等方法消除水的干扰。 自然界存在的蛋白质是许多种不同构象的多缩氨基酸，这样就会使蛋白质的酰胺I很复杂，主要是-螺旋，链和无规则多肽片段引起的峰重叠。由于这种重叠组分带的带宽很大，使人们不可能从测出谱带中鉴定。,酰胺III带由于信号较弱，过去很少应用于蛋白质二级结构测定，但由于水再次吸收带没有吸收峰，解决了严重的水汽干扰，不同二级结构在III带的光谱性质特征明显，拟合过程中易于将其分开。尤其对于I 带中因峰重叠而难以区分的螺旋和无规则卷曲结构，在III带中得以明显的分离。,酰胺III带谱峰归属：,13301290 -螺旋 12951265 -转角 12701245 无规卷曲 12501220 -折叠,其中12901295，12651270及12451250三个区域为相邻二级结构的交盖区，其归属要根据具体情况进行。,
