1、实验二 聚合酶链式反应（PCR）一、 实验原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。二、 器材与试剂1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料三、 实验步骤PCR反应体系的建立取
2、离心管，依次加入试剂混匀1H2O 12l2模板 1l3引物T7 1l4引物 sp6 1l52*PCRmix 15lPCR仪的热循环反应把离心管放入PCR仪中，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2. 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至56左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3. 引物的延伸：经加热至72左右DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列
3、为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示 加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。四、 讨论1. Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。2. 变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引
4、物与模板的结合而降低PCR扩增效率。3. EB：溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖中的DNA，可与DNA结合，用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。4. 溴酚蓝：电泳指示剂，相当于300bp的DNA的电泳速度。5. 100bp DNA Marker是由单独的PCR扩增产物混合而成，已含有1xLoading Buffer,可以直接电泳。包括11条双链DNA片断：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp。特异性加强500bp。每次上样45L。6. 模板一般采用50ng-1ug或102-105 拷贝，浓度过高反而会抑制反应的进行。7. 引物的与模板的互补程度决定了PCR的特异性，常用0.10.5uM，浓度过高则特异性下降，会形成引物二聚体影响试验结果。五、 结果及结论：经电泳检测到PCR扩增产物中出现500bp左右条带，PCR扩增成功。
