1、实验三 聚合酶链式反应(PCR)技术【原理】聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR ）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合（退火） ，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的 DNA 聚合酶（Taq 酶）在 72将单核苷酸从引物的 3端开始掺入，以目的基因为模板从 53方向延伸，合成 DNA 的新互补链。通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。【试
2、剂与用具】1. 试剂：DNA 模板 2引物（正向/ 反向各一条） 3 10PCR Buffer 42mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 5Taq 酶 6. Mg2+ 7. 灭菌 ddH2O2. 用具：PCR 仪，离心机、离心管架，移液枪， 1.5ml 离心管，8 连或 12 连 PCR 管（或者PCR 板） ，枪头，冰盒【操作步骤】1在冰浴中，按以下次序将各成分加入 0.2mL 8 连 PCR 管中。1 10PCR buffer 1 l dNTP mix （2mM） 0.2 l Mg2+ 0.8 l PrimerF（10pM） 0.5 l Primer
3、R（10pM） 0.5 l Taq 酶 （ 2U/l） 0.15 l DNA 模板（50ng-1g/l） 2.0 l ddH2O 4.85 l 总体积 10 l 视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，执行扩增。一般：在94预变性 3-5min；进入循环扩增阶段：94 40s 58 30s 72 60s，循环 31 次；最后在 72 保温 7min。3结束反应，PCR 产物放置于 4待电泳检测或-20 长期保存。4PCR 的电泳检测：取 4-6l 电泳检测。【注意事项】（1）所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染；（2）所有 PCR 试剂中用的水都应该是高质量的双蒸水；（3）所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性；（4）PCR 管和枪头都一次性使用。
