1、1第三章 蛋白质化学 1.蛋白质（Protein ）最早发现于鸡蛋，是一类含氮的复杂有机化合物。2.恩格斯指出：“ 生命是蛋白体的存在方式” ， “无论在什么地方，只要我们遇到生命，我们就发现生命和某种蛋白体相联系的；并且无论在什么地方，只要我们遇到不处于解体中的蛋白体，我们也无例外地发现生命现象”。 生命离不开蛋白体，有了蛋白体就有了生命。 蛋白体是什么？蛋白质又怎么定义？ 蛋白体就是蛋白质和核酸构成的原生质。 蛋白质是蛋白体的组成成分，是生命不可缺少的物质，凡是有生命的地方，基本上都有蛋白质在起作用。蛋白质是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具
2、有一定生物功能的大分子。 蛋白质用“ Protein”表示， “ Protein”意为“最原始” 、“最重要”。 第一节 蛋白质的生物学意义 一、蛋白质是生物体结构性物质 （结构大分子）1、从含量上看：人和动物体中蛋白质占干重的45%，其中皮肤、肌肉、肌腱、内脏、韧带、血液和毛发都以蛋白质为主，含量可高达6080%；植物体占干重的1540%，主要存在于种子和果实中，其中黄豆种子占40% ，花生仁占 26%；细菌占干重50 80%；噬菌体除了少量的核酸外几乎全是蛋白质。2、从种类上看：大肠杆菌的蛋白质含有三千种，人体含有十万种，整个自然界的蛋白质有一百亿种。第一节 蛋白质的生物学意义 二、蛋白质
3、是生物体的功能性物质 （功能大分子）1、作为生物催化剂催化生物体内一切化学反应的酶2、调节代谢反应调节代谢、生长、生殖和发育的激素3、免疫保护作用识别病毒、细菌并与之结合消除毒害作用的抗体4、运输的载体运输二氧化碳和氧气的血红蛋白，运输血脂、血糖的脂蛋白、糖蛋白，细胞膜上的各种载体5、参与肌体运动使肌肉产生舒缩活动的肌动蛋白和肌球蛋白6、接受传递信息-口腔中的味觉蛋白，视网膜中的视觉蛋白。高等动物的记忆、识别机构都有蛋白质在起重要作用。第二节 蛋白质的元素组成 常量元素（一般含有） ：C 5055%； H 68%； O 2023%； N 1518%； S 04%；2 微量元素（个别含有） ：F
4、e 、 Zn、Cu、Mn、 Mo、I 、P 。 特征性元素：N 原因是：1、在三大营养物质（糖、脂肪、蛋白质）中唯有蛋白质 含有N元素；2、在所有的蛋白质中的含N 量比较恒定，平均值为 16%，因此只要测出蛋白质中的含N量就可以粗略地计算出蛋白质的总含量。 蛋白质总含量=蛋白质含N 量6.25，这是凯氏定N法的原理 当然，不同的蛋白质实际系数是有差异的，如牛奶为6.3；小麦、花生、大豆为5. 465.95。第三节 蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的水解 酸水解：常用(4mol/L)H2SO4 或(6mol/L)HCl 进行水解 20h. 优点：可完全水解，不引起消旋 缺点：色氨酸破坏，羟基氨酸（丝、
5、 苏）部分水解，天冬酰胺、谷胺 酰胺的酰胺基水解。 碱水解：常用(5mol/L)NaOH进行水解优点：色氨酸稳定 缺点：多数氨酸不同程度破坏，并产生 消旋，精氨酸被水解为鸟氨酸和 尿素,但色氨酸稳定 酶水解：优点：不产生消旋，不破坏 AA。缺点：水解时间长；水解不彻底，中间产物多； 单一酶水解不完全。结论：将蛋白质大分子水解可得到许许多多的氨基酸，氨基酸不能再水解为更小的分子，所以说 氨基酸是蛋白质的基本组成单位。一、氨基酸的结构通式一、氨基酸的结构通式1、氨基酸结构的特点：（1）构成蛋白质的氨基酸有20种（这20 种氨基酸称为蛋白质氨基酸）；（2）均为氨基酸（即都有一个氨基和一个羧基位于碳原
6、子上，就象每各人都长有一张嘴巴和一个鼻子在脸上一样，但脯氨酸除外），共有氨基和羧基的化学性质,如两性解离；（3）有两种构型和有旋光性（甘氨酸除外），因为碳原子是手性碳原子；（4）不同AA的区别就在于R基的不同，它是构成蛋白质多样性、复杂性、化学性质、结构不同的分子基础。二、 氨基酸的分类究竟是哪20种氨基酸？可以通过分类来认识，但分类不是最终目的，我们的最终目的是通过分类搞清楚氨基酸的特点从而逐步认识有关的氨基酸，即具体的氨基酸名称、三字母符号、结构式和特性。 1、依R基组成不同分（1）脂肪族氨基酸（ R基为碳氢链，15 种）3（2）芳香族氨基酸（ R基为苯环，2种：苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸
7、（Tyr） 疏水、紫外吸收）（3）杂环氨基酸（ R基含有 S、N、O等杂原子的环， 2种：组氨酸（His）含咪唑基、色氨酸（ Trp）含吲哚基（4）杂环亚氨基酸（ 1种：Pro 含亚氨基，正常氨基是NH 2，亚氨基是NH，即亚氨基比正常氨基少一个H）2、依R基酸碱性质的不同分（1）中性氨基酸（ R基无酸碱性，15种）（2）酸性氨基酸（R基含有羧基，2种：谷氨酸Glu）含COOH、天冬氨酸（Asp）含 COOH）（3）碱性氨基酸（R基含有碱基，3种：组氨酸（His）含咪唑基、赖氨酸（Lys）含NH2、精氨酸（Arg） 含胍基） 注意：酸性氨基酸和碱性氨基酸这5种氨基酸要熟记，以方便以后学习时能将
8、结构和功能联系起来。3、依R基极性不同分（1）非极性氨基酸（疏水性氨基酸：9种甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、甲硫、脯、色）：（2）极性氨基酸（亲水性氨基酸：11种，依据在PH=7是否带电又分三小类）： 1/极性不带电荷：6种（丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸）2/带正电荷（碱性氨基酸）：3种（哪3种？3/带负电荷（酸性氨基酸）：2种（哪2种？4、非蛋白氨基酸：有180多种，在生命过程中常出现又具重要功能的有： 丙氨酸 辅酶A的成分 鸟氨酸 游离氨基酸 ，是合成尿素的中间产物 胍氨酸 游离氨基酸，是合成尿素的中间产物 胱氨酸 蛋白质合成后两个半胱氨酸结合而成 羟脯氨酸 蛋白质合
9、成后脯氨酸羟基化而成 羟赖氨酸 蛋白质合成后赖氨酸羟基化而成胱氨酸、羟辅氨酸、羟赖氨酸在蛋白质中含有，但不是蛋 白质中的基本氨基酸，叫修饰氨基酸。归纳：蛋白质中的基本氨基酸有20种，他们都是LAA。 三、氨基酸的性质一 一般物理性质（一般了解）1、色、味：白色晶体（黄色是它的盐酸盐），五味具全2、溶解度：溶于水、稀碱和稀酸溶液中3、熔点：200 0C以上，高熔点说明了什么氨基酸是离子晶体4、光学性质：有旋光性（除甘氨酸以外）45、紫外吸收：含有共扼双键的化合物有吸收紫外光的特性， 最大吸收峰：苯丙氨酸（Phe ）吸收波长为 259nm、酪氨酸（Tyr）278nm 、色氨酸（Trp）279nm
10、。是分光计测定有色物质浓度的原理。 三、氨基酸的性质二 两性解离和等电点1、两性离子定义：氨基酸分子上同时带有等量的正负两种 电荷称为两性离子。为什么说它是两性离子？ 因为氨基酸上的羧基和氨基都可以发生解离： COOH COO -+ H +; NH2 + H + NH 3+ 溶液PH与氨基酸的 PI值、带电情况：有三种： PHPI ，偏酸，带正电；PHPI ，中性，不带电；PHPI ，偏碱，带负电。一般溶液中的PH以7 决定其酸碱性，而氨基酸的PH则不是以7 为标准，而是以PI为依据。20种氨基酸的PI不一样，但大体可划分为三类：第一类：PI为6左右，中性氨基酸（因为羧基的解离度大于氨 基，加
11、入氢才能抑制羧基的解离）；第二类：PH6 ，为3左右，酸性氨基酸；第三类：PH6 ，为10左右，碱性氨基酸。3、氨基酸等电点 定义：调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的 +NH3基和COO -基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(PI)。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 核心是什么？等点！为什么等点？是羧基和氨基解离相等。3、氨基酸等电点 等电点的应用： 在偏离等电点的酸性中，氨基酸带正电，在电场中向负极移动；在碱性中，氨基酸带负电，在电场中向正极移动。因此，在非等电点的条件下可进行电泳。在等电点时，
12、溶解度最低，容易沉淀，常利用此性质分离制备氨基酸，如味精（主要成分是谷氨酸钠盐）的生产；利用各种氨基酸的等电点不同，也可将混合氨基酸分离提纯。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的 pK1 和 pK2 的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其 pI 值也决定于两性离子两边的 pK值的算术平5均值。酸性氨基酸：pI = (Pk -COOH + pKR-COOH )/2 碱性氨基酸：pI = (pK- NH3 + pKR-NH3 )/2
13、 pH PI 溶液对 PI 而言偏碱 带-PI 与 PH 的关系 pH =PI 溶液对 PI 而言中性 不带电pH PI 溶液对 PI 而言偏酸 带+ Handerson-Hasselbalch 公式: pH=Pk+lg质子受体/ 质子供体 计算在任何一 PH 条件下氨基酸的各种离子的比例 问 题 有一氨基酸溶于PH为7的溶液后，溶液中的PH上升为8，问该氨基酸的PI为多少？（ 8；8； 8？） 又问：有一氨基酸溶于PH为7的溶液后，溶液中的PH下降为6，问该氨基酸的PI 为多少？（6； 6； 6？）三氨基酸的化学反应1 -氨基参与的反应与甲醛反应用途：可以用来直接测定氨基酸的浓度（Soren
14、sen）（）与亚硝酸反应用途：收集 N2，测定含氮量，计算出蛋白质的含量，这是 Van Slyke 测定氨基酸的基础 ）与、二硝酸基氟苯反应氨基酸与二硝基氟苯（DNFB）生成 2、4二硝基苯氨基酸（DNPAA） ，后者的特点是淡黄色油状物，不溶于水，可与其他氨基酸分离，用于 N末端氨基酸的测定与 2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应式 （）与苯异硫氰酸酯（PITC）反应生成苯乙内酰硫脲（PTHAA），用于N末端氨基酸的测定，是自动测定顺序仪制作的原理，可连续测出60个氨基酸(5)与丹磺酰氯反应:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法
15、的优点是丹磺酰-氨基6酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol 。（6）酰化反应用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定等。（7）成盐反应 与HCl反应生成氨基酸盐酸盐，增加氨基酸的溶解度 2 -羧基参与的反应（）成酯反应用途：在蛋白质合成过程中，保护羧基（2）成酰卤反应用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。（3）成盐反应与 NaOH 反应生成氨基酸钠盐，也可增加氨基酸的溶解度4、R基参与的反应呈色反应反应名称 反应试剂 反应基团 颜色 用途黄色反应 浓硫酸+浓硝酸苯基、酚基黄色 Phe Tyr米伦反应 硝酸汞（亚汞） 酚基 红色 Tyr 乙醛酸反应乙醛酸 吲哚基 紫红 Trp
16、坂口反应 萘酚+NaClO胍基 红色 Arg福林酚反应磷钼酸+磷钨酸酚基、吲哚基 蓝色 Trp TyrPauly 反应重氮盐 咪唑基 酚基棕红色 桔黄色His Tyr巯基反应 亚硝酸亚铁氰酸钠巯基 红色 Cys四、氨基酸的分离分析1.层析法: 原理层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异（如溶解度、吸附力、电荷性质等），使各组分以不同程度分布在两个“相”中固定相：被固定在一定的支持介质上的那一相。流动相：在支持介质上移动的那一相。当移动相流过固定相时，在流动过程中，由于各组分在两相中的分配情况不同，电荷或亲和力不同等，以不同的速度移动，从而达到分离。层析方法跟据层析法的原理分配层析
17、法 吸附层析法 离子交换层析法 分子筛（凝胶过滤）层析法 亲和层析法根据层析法的支持介质不同7滤纸层析 薄层层析 薄膜层析等 离子交换层析法 凝胶过滤层析法 滤纸层析（分配层析）：支持物为滤纸 分配定律：一种溶质在两互不溶的相中的浓度比值与在这两种溶剂中的溶解度比值相等。 分配系数（K）=溶质在溶剂A中的浓度（溶解度） /溶质在 溶剂B中的浓度（溶解度）层析系统：层析液（展层剂）：包括有机溶剂流动相（可移动的相）和水固定相（固定在一定支持介质的相） 各种物质在层析中前进的速率用比移值（Rf）来表示 Rf = 原点到层析点中心的距离 /原点到溶剂前沿的距离 极性AA在水中溶解性大，Rf小。酸性和
18、碱性AA的极性强于中性AA，所以中性AA的Rf值大 若分子中极性基团相同，而亚甲基数增加（即分子量增大），则整个分子的极性相应降低，Rf值随之增大。（2）、离子交换层析： 离子交换树脂是一种具有酸性或碱性基团的人工合成的高分子化合物，包括阴、阳离子交联剂和水不溶性惰性载体（聚氯乙烯） 阳离子交换树脂（交换阳离子）：磺酸型：SO 3H（酸型和Na型）羧酸型：COOH（酸型和Na型） 阴离子交换树脂（交换阴离子）：季胺型：N +（CH3） 3氯型：N +（CH3）3Cl -羟基型：N +（CH3）3OH -氨型：NH 3（氯型和羟基型) 离子类型：能否交换 电荷多少、极性：交换能力的大小 洗脱顺序
19、：离子类型（电荷性质）不同，电荷多少，极性大小 混合AA对于阳离子交换一般有如下的洗脱规律：酸性AA先被洗下，接着是中性AA，碱性AA；在极性基团相同的情况下，分子量小的比分子量大的先洗下来。 由于不同的氨基酸 PI 不同，在一定的 PH 溶液中带电荷的性质不同，带电荷的多少不同，与不同的离子交换树脂的结合能力不同。 洗脱时不能结合的最先被洗脱出来，结合能力小的其次，结合能力大的最后被洗脱出来2、电泳法电泳带电质点在电场中向与本身电荷相反的电极移动的现象。常见的纸电泳以滤纸为支持物，质点所带的电荷多或质点小，移动就快（二氨基二羧基AA比一氨 基一羧基AA 移动快）。当AA处于等电点时，所带正负
20、电荷相等，在外加电场中不会移动，当介质PH小于AA的等电点时，AA带正电荷，在电场中向阳极移动，反之成立。 等电点沉淀越接近AA 的等电点，该AA 的溶解度越小，越易沉淀。 8第四节 肽一、基本慨念1、肽：一个 氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物叫做肽。两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽（具体命名时叫某某酰某某酸。如甘氨酰丙氨酸）；三个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做三肽，许许多多的氨基酸分子脱水缩合而成的化合物象链状一样，叫做多肽链。2、肽键： 一分子氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基脱水缩合而成的酰胺键叫做肽键（是特殊的酰胺键）。3、二肽的反应式H2NCHOHR
21、1+2NCHOHR2 NCHOHR2H2NCHR1O 氨基端或N-端：在多肽链中含有一个游离的 -氨基的一端，常写在左边。 羧基端或C-端：在多肽链中含有一个游离的 -羧基的一端，常写在右边。 氨基酸顺序：在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称之。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 氨基酸残基：是组成多肽链中的氨基酸，由于在形成肽键时COOH去掉 了OH，NH 3 去掉了 H，这种不完整的氨基酸分子称为氨基酸残基。 肽键两侧的原子或基团共处于同一平面上的立体结构。肽键不能旋转的
22、原因：肽键具有部分双键性质，在多肽链中，不能旋转的肽键占1/3，因此造成肽链构像的类型受到极大的限制。 5、肽平面肽键两侧的原子或基团共处于同一平面上的立体结构。肽键不能旋转的原因：肽键具有部分双键性质，在多肽链中，不能旋转的肽键占1/3，因此造成肽链构像的类型受到极大的限制。6.肽元或肽单位：是多肽中的一个基本结构单位R CHCONH（包含一个肽键，而氨基酸残基不包含肽键）第四节 肽二、活性肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。9 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：谷胱甘肽；激素类多肽；脑啡肽；抗生素类多
23、肽；蛇毒多肽等。（二）催产素和加压素（激素多肽）都是9肽 ，区别在于3 、8位：催:3I le， 8Leu，促进子宫、乳腺平滑肌收缩，催产、排乳，促进分娩；加：3Phe，8Arg ，促进血管平滑肌收缩，加压、利尿。（三）脑啡肽（镇痛肽）： Met-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Leu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu第五节 蛋白质的结构 一、一级结构 是蛋白质分子中最基本的结构。（一）一级结构的内容：是指组成蛋白质的氨基酸的连接方式和排列顺序 1、连接方式证据：1、蛋白质分子中的酸碱滴定：游离的氨基和羧基较少；2、蛋白质水解后，氨基和羧基等量增加；3、呈双缩脲反
24、应，这是直接证明蛋白质以肽键连接的最主要的证据。结论：连接方式是肽键（CONH），肽键是蛋白质一级结构的主要作用力。 2、排列顺序组成蛋白质的氨基酸只有20种，而构成的蛋白质却有许许多多，这是因为氨基酸在构成蛋白质时其种类、数量、排列顺序不同造成的。例：有A、B两种氨基酸，顺序不同就得到两种不同的肽：ACONHB；B CONHA。（二）一级结构的测定要求：分析的样品必须是均一的、已知分子量的蛋白质。方法：分6步进行1、组成与含量分析 2、末端分析 3、肽链的拆离与伸展4、肽链的部分水解及肽段的分离105、肽段的测序 6、片段重叠，推其顺序 1、组成与含量分析： 目的：了解蛋白质中氨基酸的种类、
25、每种氨基酸的含量，不是所有的蛋白质都有20种氨基酸，也不是每种氨基酸的含量都相等。 方法：用氨基酸自动分析仪蛋白质经水解后把水解液放进去测量。 蛋白质的水解常用酸（6MHCl，110 0C，24h），色氨酸（吲哚基）被破坏、天冬酰胺和谷氨酰胺被水解成天冬氨酸和谷氨酸，最多有17种；用碱（1 、5MNaOH ，110度C，1220h)专门测定色氨酸，有18种；水解完后单独测量酰胺，只能测出酰胺的个数，不知道什么位置。1.蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示如：100 克胰岛素 分析得到 phe8.6 克其重量百分数为： 残基分子量 147氨基酸分子量 1652.根据百分组成计算氨基酸的分子个
26、数如：胰岛素分子量为 6000，丙氨酸占 4.6%氨基酸个数为：氨基酸的百分含量* 蛋白质分子量 4.6%*6000氨基酸的分子量 892、末端分析： 目的：了解N末端或C 末端是什么氨基酸？肽链的条数。 方法： N末端分析：（1）、DNFB法DNFB可以与肽链末端的自由基反应，生成DNP 肽链，新生成的DNP肽链中苯核与氨基之间的键比肽键稳定，不易被酸水解，因此用酸水解DNP肽链将肽链中的所有肽键破坏，生成 DNPAA和其他AA的混合物。N末端如果是亚氨酸（Pro及Hyp），就不宜用此法，因为 DNP与亚氨酸间的键很不稳定。（2）、PITC法（Edman法，又称PTH 法）用于AA自动分析仪。PITC 与肽链N末端作用，形成PTC 肽链，酸性条件下生成PTHAA。（3）、 DNS法荧光试剂，比DNFB 灵敏度高 100倍。（4）、 氨肽酶法从N 末端逐个水解肽链，控制水解时间、酶量，跟踪测定AA的量，量大的为N末端，不能水解蛋白质。 C末端分析：（1）肼解法可知：多肽与肼在无水条件下加热可断裂所有的肽键，除C末端AA外，其他AA 转变为酰肼化合物。肼解下来的C 末端 AA借DNFB 试剂的作用转变为DNPAA ，再加以鉴定。缺点：以门冬酰氨、谷氨酰氨和半胱氨酸、精氨酸为C末端的多肽不能准确测定。（2 ）羧肽酶法
