1、一种新型杀菌剂制备及性能研究完成日期： 指导教师签字： 答辩小组成员签字： 一种新型杀菌剂制备及性能研究摘 要本论文对高分子质量的壳聚糖进行分子修饰，在水浴条件下使一定量的壳聚糖、二甲基亚砜和碘甲烷在碱性环境中反应适当时间，合成一种N上取代季铵盐的壳聚糖抗菌剂，季铵盐壳聚糖。所得水溶性季铵盐壳聚糖（TMC）采用傅里叶红外光谱检测（FT-IR）进行表征和分析。研究TMC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性能，以未修饰的壳聚糖作为对照。结果表明：TMC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，而壳聚糖对两种受试菌则没有明显的抑菌效果。针对TMC筛选出中和试剂，卵磷脂。研究TMC与细菌接触作用5分
2、钟，10分钟，15分钟和20分钟时的抑菌效果。结果显示：接触时间越长，TMC的抑菌效果越好。本项研究对更好的开发利用季铵盐壳聚糖，使其成为成熟的杀菌剂具有十分重要的意义。关键词：壳聚糖；季铵盐；杀菌剂；中和剂The Preparation of A New Fungicide And Its PropertiesAbstractIn this paper, the polymer molecular mass of chitosan modified conditions under the water bath a certain amount of chitosan, dimethyl s
3、ulfoxide and methyl iodide an appropriate time in an alkaline environment, the synthesis of an N-substituted season ammonium salt of chitosan antimicrobial agent, a quaternary ammonium salt of chitosan. The resulting water-soluble quaternary ammonium salt of chitosan (TMC) using Fourier Transform In
4、frared Spectroscopy (FT-IR) were characterized and analyzed. Study on the antimicrobial properties TMC Escherichia coli, Staphylococcus aureus, unmodified chitosan as a control. The results showed that: TMC for Escherichia coli and Staphylococcus aureus has certain inhibitory effect, while the two t
5、ested bacteria Chitosan is no significant inhibitory effect. TMC screened for neutralizing agents, lecithin. Research TMC contact with bacteria for 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes and antibacterial effects of 20 minutes. The results show: The longer the contact time, the better inhibitory effect T
6、MC. Study for a better exploitation of the quaternary ammonium salt of chitosan, making it a proven fungicide has very important significance.Key words: chitosan; quaternary ammonium salt; germicide; neutralizing agent目 录0前言41实验材料及仪器61.1实验材料与试剂61.2实验仪器62实验方法82.1季铵盐壳聚糖的合成82.2壳聚糖和季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征82.3季铵盐
7、壳聚糖的抑菌性能检测82.3.1 培养基的配制及试剂的准备82.3.2菌株接种与培养92.3.3测定与分析102.4季铵盐壳聚糖中和剂的筛选102.5季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价113实验结果分析123.1季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征123.2季铵盐壳聚糖的抑菌性能检测123.3季铵盐壳聚糖中和剂的筛选143.4季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价153.4.1季铵盐壳聚糖对金黄葡萄球菌的抑菌效能153.4.2季铵盐壳聚糖对大肠杆菌的杀菌效能174总结194.1论文主要结论194.2存在的问题与可持续研究的问题194.3季铵盐壳聚糖作为杀菌剂的前景展望19参考文献20致谢220前言自然界中存在大量的有害微
8、生物，不仅危害人们的健康，而且引起各种材料的分解、变质和腐败，危害环境和工农业生产，带来重大经济损失1。阻止有害微生物，目前最有效的方法是依靠化学试剂，也就是杀菌剂2。杀菌剂又称杀生剂、杀菌灭藻剂、杀微生物剂等，通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物细菌、真菌和藻类的化学制剂3。壳聚糖（CS）是一类资源丰富的天然氨基多糖，可由广泛存在于节肢动物外壳和真菌类细胞壁中提取的甲壳素经脱乙酰化制得，具有良好的生物降解性、生物相容性，且无毒副作用4，其优越的生物活性功能、良好的成膜特性和较强的抗菌防腐保鲜能力已引起国内外研究人员的广泛关注和重视5。但是壳聚糖由于分子中含大量的-OH和-NH2，形成复
9、杂的氢键作用，只能在酸性条件下使用，而且壳聚糖不溶于水及大部分有机溶剂，抑菌应用场合受到了很大的限制6。季铵盐类化合物于1915年首次合成，继而发现该化合物有一定的杀菌作用7。经进一步研究表明，季铵盐的氨基能够与微生物的细胞膜发生静电吸附作用，从而可以杀灭细菌、真菌和病毒8。季铵盐化合物以其广谱高效的杀菌性能，以及使用范围广、水溶性好、性质稳定、安全低毒、价格便宜等诸多优点，在自然环境、医院消毒、机械设备的表面和防生材料等方面具有非常广泛的应用9。后经实验证明，如果在壳聚糖分子上引入季铵盐侧链，就可以增加正电荷的数量，从而大大改善它的水溶性，并且具有更强的抑菌能力，对革兰氏阳性菌和阴性菌均显示
10、出较好的抑菌效果10。在自然环境、医院消毒、机械设备的表面和防生材料等方面具有非常广泛的应用。因此季铵盐壳聚糖作为一种生物杀菌剂具有广阔的应用价值11。经过研究发现，虽然季铵盐类消毒剂抑菌作用强大，但在杀菌试验中必须有效去除残留药物的干扰，才能真实地检测出其实际杀菌效果，此问题一直没有得到很好解决。随着消毒剂配方越来越复杂，残留消毒剂的去除已成为评价此类消毒剂的技术难题12。本论文拟合成一种季铵盐壳聚糖，检测季铵盐壳聚糖对不同菌种的抑菌效果，研究季铵盐壳聚糖水溶液的稳定性，验证其是否可以作为一种生物抑菌剂，同时筛选出针对季铵盐壳聚糖杀菌剂的中和剂，为产品开发奠定理论基础。1实验材料及仪器1.1
11、实验材料与试剂季铵盐壳聚糖：由本实验室自行制备；壳聚糖分析纯购于青岛宏海生物技术有限公司；碘甲烷分析纯购于上海山浦化工有限公司；二甲基亚砜分析纯购于天津市广成化学试剂有限公司；磷酸氢二钠分析纯购于江苏强盛化工有限公司；盐酸分析纯购于莱阳经济技术开发区精细化工厂；蛋黄卵磷脂、营养琼脂粉、营养肉汤粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、乙醇购于国药集团化学试剂有限公司；培养基：（1）液体培养基：使用营养肉汤粉和蒸馏水配制成浓度为1.9%（w/v）的液体培养基； （2）固体培养基：使用营养琼脂粉和蒸馏水配制成浓度为3.3%（w/v）的固体培养基；菌株：（1）金黄色葡萄球菌（Staphyloc
12、occus aureus，S.aureu）； （2）大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）,均由本实验室提供1.2实验仪器电子天平型号：AB104-N上海美特勒托利多公司振荡培养箱型号：HZQ-X100哈尔滨市东电子技术有限公司磁力搅拌器型号：RO10德国 IKA公司电热恒温培养箱型号：DHP-9052上海齐欣科学仪器有限公司垂直流桌上型超净工作台型号：SCW-CZ-650苏州宏瑞净化科技有限公司集热式恒温加热磁力搅拌器型号：DF-101S河南省予华仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅型号：GI45DS上海博讯实业有限公司傅立叶红外光谱仪型号：Nicolet-380美国热电集团移
13、液器德国Eppendor公司数显酸度计奥豪斯仪器（上海）有限公司冻干机美国SIM有限公司2实验方法2.1季铵盐壳聚糖的合成 15%NaOH溶液的配制：称量3g氢氧化钠，溶于17ml水中，配制成氢氧化钠溶液。准确称取2g壳聚糖粉末加入装有12ml 15% NaOH溶液的平底烧瓶中，室温溶胀10min，然后加入80ml二甲基亚砜、12ml碘甲烷，60水浴加热，反应60分钟。60分钟后，再往烧瓶中加入6ml 15%的NaOH溶液和6ml碘甲烷，继续反应60min。反应结束后，加入无水乙醇，出现白色沉淀，终止反应，透析三天，用冻干机将产品冻干，即得水溶性的季铵盐壳聚糖。2.2壳聚糖和季铵盐壳聚糖物的红
14、外光谱表征 用Nicolet-380型红外光谱仪进行分析。分别将壳聚糖和季铵盐壳聚糖与溴化钾1:5比例充分混合，压缩5分钟成片。光谱分辨率2cm-1，测量范围：420-4000cm-1，扫描次数：30次。2.3季铵盐壳聚糖的抑菌性能检测采用平板涂布法，以只含有菌液的PBS溶液为空白对照组，添加壳聚糖或季铵盐壳聚糖的菌液为实验组，观察作用相同时间后菌落的生长情况，检测季铵盐壳聚糖的抑菌性能13。2.3.1 培养基的配制及试剂的准备准确称取一定量的营养琼脂放置到500mL的三角瓶中，加入适量的蒸馏水，配制成浓度为3.3%（w/v）的固体培养基，然后放置在磁力搅拌器上搅拌溶解，搅拌速度为300rpm
15、。用精密pH试纸测量营养肉汤的pH值。若pH小于7.6，则在搅拌状态下，向营养肉汤中逐滴加入1moL/L NaOH溶液，用pH试纸检测pH值，直至培养基pH达7.6。反之，则用1moL/L HCL溶液进行调节，同样调节至pH达7.6为止。待完全溶解后放入立式蒸汽灭菌锅中，于121C下，高温灭菌20min。灭菌后趁热倒入到培养皿中冷却，制备营养琼脂固体培养基。准确称取0.1g壳聚糖，并置于紫外灭菌台灭菌备用。准确称取0.1g季铵盐壳聚糖，并置于紫外灭菌台备用。PBS缓冲液的配制：准确称取7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4(或者1.44gNa2HPO4)和1.8gK2HPO4
16、，溶于800mL无菌蒸馏水中，使其完全溶解。用精密pH试纸测量溶液汤的pH值。若pH小于7.4，则向PBS溶液中逐滴加入1moL/L NaOH溶液，变加变搅拌，并经常用pH试纸测定其pH值，直至培养基pH达7.4。反之，则用1moL/L HCL溶液进行调节，同样调节至pH达7.4为止。最后加蒸馏水定容至1L，所得溶液即为PBS溶液（磷酸缓冲盐溶液），保存于4冰箱中即可。2.3.2菌株接种与培养用接种针接种适量的金黄葡萄球菌，浸入装有10mL无菌营养肉汤的试管中，快速震荡2min，使接种针上的细胞脱离下来均匀进入液体培养基中，静置20-30s，振荡培养24h。培养后，用灭菌移液器移取0.5mL菌
17、液至装有4.5mL无菌应羊肉汤的试管中，吹打3次，让管内菌液混合均匀，即制得10-1的菌悬液，然后重复上述步骤调整菌液浓度，使每毫升菌液稀释液中菌的数量为106个。取三个洁净的锥形瓶，分别向其中加入9mL PBS溶液，并将紫外灭菌后的壳聚糖和季铵盐壳聚糖分别加入到其中两个锥形瓶中，使其充分溶解后，分别向三个锥形瓶中加入1mL菌液，摇床培养12h。培养后，用灭菌移液器移取0.5mL的菌液至装有4.5mL无菌PBS的试管中，吹打3次，让管内菌液混合均匀，即制得10-1的菌悬液。再用灭菌移液器移取0.5mL 10-1菌悬液至装有4.5mL无菌PBS的试管中，吹打3次，让管内菌液混合均匀，即制得10-
18、2的菌悬液。将10-2的菌悬液涂布到灭菌冷却后的营养琼脂平板上。具体方法是：待培养基凝固后，用无菌吸管吸取0.2mL菌悬液对号接种在营养琼脂平板上（每组设两个重复）。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个平板用一个灭菌涂布棒，更换平板时需将涂布棒灼烧灭菌。将涂布好的平板放于桌上20-30min，使菌液渗入培养基内，然后将平板倒转，置于恒温培养箱中，在37C条件下恒温培养。2.3.3测定与分析在37C条件下恒温培养24h后，将每组实验平板的菌落数目进行计数，其中只添加菌液而未加入壳聚糖或者季铵盐壳聚糖的菌悬液作为空白对照组。若只有空白对照组上有菌落生长，壳聚糖组和季铵盐壳聚糖组均无菌落生长，
19、则证明壳聚糖和季铵盐壳聚糖都有一定的杀菌效果；若空白对照组和壳聚糖组均有菌落生长，只有季铵盐壳聚糖组无菌落生长，则证明只有季铵盐壳聚糖有杀菌效果，壳聚糖并无杀菌效果；若空白对照组和季铵盐壳聚糖组均有菌落生长，壳聚糖组无菌落生长，则证明起杀菌效果的为壳聚糖，而季铵盐壳聚糖并无杀菌作用；若三组培养基上均有菌落生长，则证明季铵盐壳聚糖和壳聚糖均无杀菌效果；若三组培养基上均无菌生长，则证明实验过程中出现错误，实验失败。2.4季铵盐壳聚糖中和剂的筛选中和剂鉴定试验是评价化学消毒剂杀菌效果试验中必不可少的预备试验,科学评价消毒剂杀菌有效浓度和作用时间,及时去除残留消毒剂对试验微生物的作用是评价成功的前提和
20、基础14。实验采用6g/L的蛋黄卵磷脂溶液为中和剂，选取大肠杆菌为受试菌种。菌悬液制备参照2.3.1。实验设置五组，每组所需添加的试剂及用量为：1. 0.1mL菌液，5mL季铵盐壳聚糖溶液；2. 0.1mL菌液，5mL季铵盐壳聚糖溶液；3. 0.1mL菌液，5mL中和产物（季铵盐壳聚糖溶液和蛋黄卵磷脂溶液按照1:9的比例充分反应后即得中和产物）；4. 0.1mL菌液，5mL 无菌PBS溶液；5. 0.1mL菌液，5mL中和试剂。反应持续十分钟后，向1组中加入4.5mL中和试剂（作为对照组），其余四组中加入4.5mL无菌PBS溶液。菌种接种及培养参照2.3.2。恒温培养箱中培养24h后，将营养琼
21、脂固体培养基取出，观察菌落的生长情况，并对菌落数目加以统计。若1组培养基上有部分菌落生长，则证明蛋黄卵磷脂可以中和季铵盐壳聚糖的杀菌作用，即蛋黄卵磷脂可作为季铵盐壳聚糖的中和试剂；若1组培养基上无菌落生长，则可能是由于杀菌时间过长，或者蛋黄卵磷脂无法中和季铵盐壳聚糖的杀菌作用，此时应缩短杀菌时间，重复上述实验。2.5季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价本实验的受试菌为金黄葡萄球菌和大肠杆菌。中和试剂的配制：准确称取1.8g卵磷脂溶于30mL无菌蒸馏水，加入转子后将其放置在磁力搅拌器上，使其完全溶解。季铵盐壳聚糖稀释液的制备：准确称量0.1g季铵盐壳聚糖溶于10mL无菌蒸馏水中，振荡至充分溶解，用无菌移液
22、器移取1mL该溶液至装有9mL无菌PBS溶液的试管中，振荡至混合均匀。本实验分为五组，每组所需添加试剂、试剂的用量及反应时间如下：编号试剂及用量反应时间11ml供试菌菌液，1ml季铵盐壳聚糖稀释液5min21ml供试菌菌液，1ml季铵盐壳聚糖稀释液10min31ml供试菌菌液，1ml季铵盐壳聚糖稀释液15min41ml供试菌菌液，1ml季铵盐壳聚糖稀释液20min51ml受试菌菌液待到达预设反应时间后，用无菌注射器吸取5mL中和剂，通过无菌滤嘴分别加入到1、2、3、4组中。为了保证实验结果的准确性，向5组中加入6mL无菌PBS溶液，作为空白对照组。在恒温培养箱中培养24h后，将营养琼脂固体培养
23、基取出，并对培养基上生长的菌落进行数目统计。抑菌率的计算：抑菌率=（空白对照组菌落数目实验组菌落数目）/空白对照组菌落数目*100%。3实验结果分析3.1季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征图1. 季铵盐壳聚糖和壳聚糖的红外光谱图Fig1. IR Spectra of TMC对比壳聚糖与季铵盐壳聚糖的红外谱图（图1），可以看出：壳聚糖与其季铵盐的红外图谱非常相似，显著差别是TMC谱图中的伯胺基的N-H面内弯曲振动引起的中强吸收峰小，而在1480cm-1左右处出现甲基的C-H弯曲振动强吸收峰，1599cm-1处的酰胺基吸收峰减弱。3.2季铵盐壳聚糖的抑菌性能检测图2.三种培养基上的菌种数量 Fig2.
24、Number of species on the three media由图2可知，与空白对照组相比较，壳聚糖未表现出抑菌作用，而TMC处理组中未检测到菌落生长，表现出明显抑菌作用。金黄葡萄球菌是革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，结构紧密。然而TMC大分子可溶于水，侧链的季铵盐基团NH3+可以和金黄葡萄球菌细胞壁上丰富的磷壁质酸、荚膜多糖等牢固结合，使细胞膜通透性增加，细胞壁的完整性收到破坏或者趋于溶解，导致细胞内容物（DNA、RNA）发生泄漏，细胞死亡。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，细胞壁较薄，有肽聚糖和脂多糖层等多层结构。TMC骨架上的氨基可能同脂多糖中的多个重复单位的O-特异侧链牢固结合，形成了细胞
25、表面的高分子聚合膜，导致细菌的营养物质和代谢产物的交换受到阻止，细胞无法进行正常的生理活动，从而导致细菌死亡。3.3季铵盐壳聚糖中和剂的筛选图3. 季铵盐壳聚糖中和剂的筛选Fig3. Screening of neutralizer TMC其中2组营养琼脂固体培养基上几乎没有菌落生长，3组、4组、5组营养琼脂固体培养基上菌落生长的很旺盛，1组营养琼脂固体培养基上仅有几个菌落生长。根据中国人民共和国轻工行业标准中对于日化产品抗菌抑菌产品中和试剂的筛选规定：第2组不长菌或者明显少于第1组；第1组菌数明显少于第3、4、5组；第3、4、5组菌数相似，且误差率不超过15%16。得出结论：季铵盐壳聚糖对大
26、肠杆菌的抑菌作用可以被蛋黄卵磷脂溶液（6g/L）终止，表明蛋黄卵磷脂可以作为季铵盐壳聚糖的抑菌中和试剂。3.4季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价3.4.1季铵盐壳聚糖对金黄葡萄球菌的抑菌效能图4. 不同时间后TMC对金黄葡萄球菌的抑菌效果Fig4. After different time TMC Staphylococcus aureus antibacterial effects由图4得出，当TMC与金黄葡萄球菌作用时间为5分钟时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为994个；当TMC与金黄葡萄球菌作用时间为10分钟时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为102个；当TMC与金黄葡萄球
27、菌作用时间为15分钟时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量46个；当TMC与金黄葡萄球菌作用时间为20分钟时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为19个。而没有加入过TMC的金黄葡萄球菌稀释液在营养琼脂固体培养基上培养24h后生长的菌落个数为2435个。由此，TMC对于金黄葡萄球菌有显著的抑菌作用。图5. 季铵盐壳聚糖在不同抑菌时间内对金黄葡萄球菌的抑菌率Fig5. TMC Staphylococcus aureus inhibition rates at different times antibacterial 从图5可以看出，季铵盐壳聚糖对于金黄葡萄球菌的抑菌效果随抑菌时间增
28、长而显著提高，在抑菌时间为5min时，TMC对金黄葡萄球菌的抑菌率为59.17%；在抑菌时间为10min时，TMC对金黄葡萄球菌的抑菌率为95.81%；在抑菌时间为15min时，TMC对金黄葡萄球菌的抑菌率为98.11%；在抑菌时间为20min时，TMC对金黄葡萄球菌的抑菌率为99.22%。因此，在杀菌时间为20分钟的时候，季铵盐壳聚糖对于金黄葡萄球菌的杀菌率已接近100%,表现出杀菌效果。3.4.2季铵盐壳聚糖对大肠杆菌的杀菌效能图6. 不同时间后TMC对大肠杆菌的抑菌效果Fig6. After different time TMC inhibitory effect on E. coli由
29、图6可以看出，当TMC与大肠杆菌作用时间为5min时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为69个；当TMC与大肠杆菌作用时间为10min时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为65个；当TMC与大肠杆菌作用时间为15min时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为30个；当TMC与大肠杆菌作用时间为20min时，营养琼脂固体培养基24h后生长的菌落数量为22个。而没有加入过TMC的大肠杆菌稀释液在营养琼脂固体培养基上培养24h后生长的菌落数为293个。结果表明，季铵盐壳聚糖对于大肠杆菌有显著的抑菌作用。图7.季铵盐壳聚糖在不同抑菌时间内对大肠杆菌的抑菌率Fig7. TMC in
30、hibition rate of E. coli inhibition in different time从图7可以看出，季铵盐壳聚糖对于金黄葡萄球菌的杀菌效果随杀菌时间增长而显著提高。在抑菌时间为5min时，TMC对大肠杆菌的抑菌率为76.45%；在抑菌时间为10min时，TMC对大肠杆菌的抑菌率为77.82%；在抑菌时间为15min时，TMC对大肠杆菌的抑菌率为89.76%，在抑菌时间为20min时，TMC对大肠杆菌的抑菌率为92.49%。由此，在杀菌时间为20分钟的时候，季铵盐壳聚糖对于大肠杆菌的抑菌率已接近100%，表现出抑菌效果。4总结4.1论文主要结论1. 根据红外谱图来看，此次实
31、验成功合成了季铵盐壳聚糖。2. 季铵盐壳聚糖对金黄葡萄球菌具有明显抑菌作用，TMC可作为抑菌剂使用。3. 筛选出卵磷脂溶液（6g/L）为TMC抑菌作用的有效中和试剂。4. 利用中和试剂客观准确评价了TMC的抑菌效能，表明TMC对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效能随作用时间延长显著增强。4.2存在的问题与可持续研究的问题 1. 本文仅对金黄葡萄球菌和大肠杆菌作为供试菌检测季铵盐壳聚糖溶液的杀菌效果，实验对象种类较少，季铵盐壳聚糖对于其他菌种的杀菌性能有进一步研究的可能，为季铵盐壳聚糖作为良好生物杀菌剂提供依据。2. 本文仅测定季铵盐壳聚糖确实有一定的杀菌效果，但是季铵盐壳聚糖的最小杀菌浓度、最短杀
32、菌时间及最适作用温度等尚未测出。3. 本文筛选出卵磷脂可作为季铵盐壳聚糖的中和试剂，但从实验数据看来可能卵磷脂作为季铵盐壳聚糖中和试剂的最适浓度以及最适比例尚未得出。4.3季铵盐壳聚糖作为杀菌剂的前景展望 季铵盐壳聚糖作为一种生物杀菌剂，对环境的影响没有化学杀菌剂对环境的影响严重。可以进一步对其杀菌功效加以研究、开发和利用，使其成为体系成熟的生物杀菌剂。季铵盐壳聚糖在杀菌剂行业尚有可观前景17。参考文献1 宋玉民，常彩萍，达文燕，等壳聚糖的改性及抑菌性研究J西北师范大学学报，2010，46(3)：71-74 2 Sun Liping, Du Yumin, Shi Xiaowen,etal. A
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