1、微生物,微生物探究历程显微镜下的微生物微生物的营养微生物传染病的传播和预防,荷兰人列文.虎克：显微镜的发明者，1674年首次揭示了一个崭新的微生物世界,巴斯德（近代微生物学家和奠基人）,巴斯德的理论研究,巴斯德的曲颈瓶实验证明：在无菌条件不可能产生微生物，并提出“生生论”发明了“巴氏消毒法”解决了啤酒、葡萄酒的保鲜问题。提出了：（1）发酵是一个微生物参与过程（2）微生物致病论，并发明了疫苗,科赫：1843-1910年德国细菌学家,科赫的杰出贡献,1876年，科赫发明了固体培养基，将微生物样品稀释后，用针尖沾取少量的稀释菌液在固体培养基上划线，不久培养基的表面就会长出多种菌落。他用实验证实了“生
2、生论”1882年发现并分离出了引起肺结核的病原菌和结核分支杆菌； 1905年，科赫因结核杆菌的研究成果而获诺贝尔生理学及医学奖。,微生物的实验室培养、分离技术,培养基的配制和灭菌微生物的接种和抑菌现象的观察土壤中自生固氮菌、放线菌和真菌的分离几种不同自生固氮菌的分离营养缺陷型细菌的筛选验证细菌分布的广泛性调查校园空气中的细菌含量自来水和饮用水中大肠杆菌是否超标混合生长在一起的几种微生物的分离,一、微生物的实验室培养,配制培养基灭菌接种：微生物实验的基本技术培养观察镜检,（一）配制培养基,配制培养基的原则培养基的种类配制培养基的步骤,1、培养基配制的原则,目的明确。营养要协调。 牛肉膏：蛋白胨：
3、Nacl=1：2：1物化条件要适宜。如pH、渗透压等。,根据物理性质分固体培养基半固体培养基液体培养基根据化学成分分合成培养基天然培养基根据用途分选择培养基鉴别培养基,2、培养基的种类,选择培养基,选择培养基功能：使混合菌中的劣势菌变为优势菌，而将其从菌群中分离出来。方法1：采用“投其所好”的策略。加富的物质是特殊的碳源和氮源。如：自生固氮菌（甘露醇）；酵母（较浓的糖液）；分解石油的微生物（石油蜡）。方法2：“取其所抗”。利用分离对象对某种制菌物质的抗性。如：,选择性培养基,加入青霉素的培养基加入高浓度食盐的培养基 不加氮源的无氮培养基 不加含碳有机物的无碳培养基 加入青霉素等抗生素的培养基,
4、3、配制培养基的主要步骤,计算（如含结晶水化合物用量的计算）称量（精密电子天平）溶化定容（分别溶解再混合加热，最后加琼脂）调节pH,培养基的灭菌（分装）培养基的分装（灭菌）冷却后倒置平板或者搁置斜面后冷却备用无菌效果的检测 无菌接种无菌镜检,（二）灭菌和无菌操作技术,将完全熔化的上述培养基趁热倒入1000mL的三角瓶中，用牛皮纸扎紧瓶口后，接种环、培养皿、烧杯等用牛皮纸抱好一起灭菌，置于灭菌锅中于121，15-30min。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，至少留有1/3的空间，否则会影响灭菌效果。,1、高压蒸汽灭菌法,表1 灭菌的温度和时间对营养成分的破坏,表2 不同温度下高压灭菌对糖类的破坏
5、,高压蒸汽灭菌锅的构造,操作过程,加水装锅加盖排气灭菌起锅,操作过程,影响高压蒸汽灭菌效果的主要因素,灭菌物体含菌量的影响灭菌锅空气排除程度的影响灭菌对象pH的影响灭菌对象的体积,表3 芽孢数目和灭菌所需时间的关系,表4 空气排除度对灭菌温度的影响,表5 pH对灭菌时间的影响,表6 不同容量的液体在加压灭菌锅内的灭菌时间,2、培养基的分装,启动超净工作台 提前30分钟开启紫外灯杀菌无菌风扇，防止空气对流。 分装培养基 灭菌后的培养基冷却至50左右，在启动的超净工作台上打开三角瓶的牛皮纸，用酒精灯火焰灼烧瓶口后，将培养基分别到入灭过菌的培养皿中备用，加培养皿盖。注意： 在火焰附近能形成一个无菌区
6、，应在火焰附近操作；,倒平板一般每个培养皿倒入培养基20mL左右； 试管1/5（固体培养基）；试管1/3（半固体培养基）；试管1/4（液体培养基）；冷却后倒置培养皿和冷却前试管搁置斜面以备用。 将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。,2、培养基的分装,3、接种,接种技术：是微生物实验和相关研究的基本技术。无菌操作：是微生物接种技术的关键,接种前的消毒,实验室和超净工作的消毒提前30min开启超净工作台，打开紫外灯。操作者衣着和手消毒用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精(体积分数为70%)棉球擦拭双手。当手上的酒精挥发完毕后，点燃酒精灯。注
7、意：一定要等手上的酒精挥发完毕后，再点燃酒精灯，否则，容易将手烧伤。,常用接种方法,平板划线法平板涂布法点接法倒平板法,（1）平板划线接种操作,（1）平板划线接种操作,（1）平板划线接种操作,（2）试管接种操作,（2）试管接种操作,（2）试管接种操作,对实验操作的空间操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。,3、无菌操作内容,4、消毒和灭菌的方法及应用,4、消毒和灭菌的方法及应用,5、接种后注意事项,熄灭酒精灯。实验后的带菌培养
8、基，如果用的是致病菌，必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后方能倒掉；如果是非致病菌，也要经加热后再倒掉。贴标签。 接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者姓名填写在标签上贴在培养皿底部或者试管上。,（三）培养和观察,将接种后的试管放入恒温箱内，在25下培养57d，或在37下培养24-48h。,观察菌落的形状、大小,镜检,实验1.3 抗生素对微生物的抑制现象的观察,稀释101倍青霉素,稀释102倍青霉素/氯霉素,稀释103倍青霉素和氯霉素,枯草杆菌,拓展1 调查校园空气中的细菌含量,牛肉膏蛋白胨培养基。采集细菌。方法：自然沉降法。注意:采集高度为1.2-1.5m，采集点远离墙壁1以上.并避开空调、门窗等空气
9、流通处。采集地点应具有典型型和代表性。采集时间：上午、中午和傍晚。,确定子课题,课题1 校园各区域细菌含量课题2 教室通风前后细菌的含量课题3 实验室消毒前后的细菌含量,表1 校园各区域的菌落数量统计,表2 教室通风前后的菌落数统计,表3 实验室消毒前后的菌落统计,拓展2验证细菌分布的广泛性,牛肉膏蛋白胨平板,头发,桌子,硬币对照,四 课题 用选择性培养基分离土壤中自生固氮菌,实验目的1、初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法。2、初步学会临时涂片的制作方法。器材：无菌培养皿、无菌研钵、恒温箱等。,（一）实验操作,制备无菌的无氮培养基阿仕比无氮培养基成分： C6H12O6 10g， CaSO4
10、5g， K2HPO4 0.2g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.2g， 定容1000ml，pH7.0。土样取样制备稀泥浆液,接种 方法：点接法或者划线法 在超净工作台上,（一）实验操作,（二）培养和观察,培养 28-30恒温箱中培养3-4天。观察 观察菌落的形状、大小和颜色镜检 结晶紫染色1分钟呈紫色的细菌就是自生固氮菌。杆状或短杆状，周围有荚膜。,不同稀释倍数土壤液接种后菌落的生长情况,镜检,在超静工作台上用灭过菌的接种环挑取单个菌落。接种在阿仕比无氮斜面培养基上，经培养后冷藏在冰箱中保存。,（三）纯化保存,小课题 影响因素的设计,土壤取样：（1）不同深度土层取样，如地表以下3-5cm（
11、2）从不同的土壤取样，如壤土、砂质土土壤稀释度：101，102，103，104，105接种方法： 点接法、平板划线法或者涂布平板法,方法:通用培养基+青霉素原理:由于青霉素是细菌细胞壁的合成抑制剂，利用其可杀死正在繁殖的细菌的性质，对所有青霉素敏感菌的一种方便的选择法。,拓展3 筛选营养缺陷型细菌,操作步骤1、将细菌先在完全培养基中培养24小时，离心分离菌体，即用生理盐水（0.850.95NaCl溶液）反复离心洗涤23次。、在加有青霉素（100300单位/升）的基本培养基中于最适温度中培养24小时。凡是原来野生型细胞会不断分裂，因不能形成新的细胞壁而死亡。、将菌悬液放在完全琼脂培养基进行平面培
12、养，在平面上长出来的菌落大多为营养缺陷型,拓展3 筛选营养缺陷型细菌,拓展4 黏液中有三种自生固氮菌， 怎样分离？,稀释菌液 用无菌水将黏液进行大量稀释，目的是使黏液中的自生固氮菌相互分离开来。接种 点接法接种到培养基上培养（15-20处）镜检 如果发现还有不同形态的固氮菌，说明不同种类的自生固氮菌尚未分离，还需要进一步的稀释，直到镜检时看到只有一种形态的自生固氮菌时为止。,拓展5 检测饮用水和自来水中大肠杆菌是否超标,指标：我国规定1000mL自来水中的大肠杆菌数不可超过3个。检测方法：滤膜法检测过程:,材料用具 将漏斗、醋酸纤维素滤膜、三角瓶、抽滤瓶、培养皿、镊子置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌1
13、21,20分钟。取水样 无菌的三角瓶接取水1000mL水样，盖好瓶盖。配制伊红-美蓝培养基滤过菌种 将漏斗和抽滤瓶固定好，用镊子夹住滤膜边缘；使粗糙面朝上放在漏斗上。将水样倒入漏中，边抽滤边加水。,拓展5 检测饮用水和自来水中大肠杆菌是否超标,接种 滤完后用镊子将附有细菌的滤膜取出，放在培养基上，使滤膜与培养基完全贴紧，不能有气泡。培养 按上述步骤制作3份。然后将培养皿放在37恒温箱下培养20小时。观察 滤膜上出现的深紫色菌落即为大肠杆菌菌群；取3份样品菌落数的平均数。根据实验结果得出结论。,拓展6 检测饮用水和自来水中大肠杆菌是否超标,伊红-美蓝乳糖培养基成分,蛋白胨 10g乳糖 5g蔗糖
14、5gK2HPO4 2g伊红Y 0.4g 美蓝 0.065g蒸馏水 1000mLPh = 7.2,拓展7 检测土壤中放线菌的数量,一般采用稀释平板测数法材料用具 肥沃田园土、90mL无菌水、9mL无菌水、高泽氏一号培养基 无菌培养皿、 1mL无菌吸管、天平、记号笔、接种环、酒精灯。,高泽氏一号培养基配方可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1.0gK2HPO4.3H2O 0.5 gMgSO4.7H2Og 0.5 gFeSO4.7H2Og 0.1 g 琼脂 15-20g定容 1000mLpH 7.4-7.6,拓展7 检测土壤中放线菌的数量,步骤一：样品稀释液的制备（重复） 步骤二：混合
15、平板接种培养（用量） 步骤三：培养 在28-30 下培养4d。至菌落长出后即可计数。步骤四 测量及结果统计步骤五 计算菌落数,拓展7 检测土壤中放线菌的数量,表 测量及结果统计,计算菌落数,1、计算结果时，按下列标准从接种后稀释的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌量。（1）同一稀释度各个重复的菌落数相差不太悬殊。（2）放线菌以每皿30300个为宜。2、选择好计算的稀释度后，根据菌落数。可计算出土壤中放线菌的数量。3、计算公式： 每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数 X 稀释倍数,五 微生物的计数的方法,直接法1、血球板记数板法2、比例计算法（很粗）间接法1、液体稀
16、释法2、平板菌落计数法：是最常用的活菌计数法。 (1)涂布平板法(体积不大于0.1mL)、 (2)倒平板法(体积0.1-1mL),103倍土壤稀释液倒平板接种后第9天,拓展8 分离、培养土壤真菌的马丁氏培养基,马丁氏培养基（选择性合成培养基）K2HPO4 gMgSO4.7H2Og 0.5 g蛋白胨 5.0g葡萄糖10.0g孟加拉红 33mg,琼脂 15-20g加蒸馏水定容 1000mLpH 自然 灭菌 113 30min无菌操作向100mL培养基加入1%链霉素0.3mL,拓展8 分离、培养土壤真菌的马丁氏培养基,拓展9 现有金黄色葡萄球菌、酵母菌、消化细菌、原褐固氮菌和乳酸菌等微生物混在一起的液体。,请设计实验，利用培养基成分等营养条件，将它们分离。,六 纯种微生物的分离方法,平板划线法分离稀释涂布或者点接分离法利用选择性培养基分离,
