1、酶切与连接,核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 分两类：1 核酸外切酶，从核酸链的一端逐个水解核甘酸的核酸酶。 2 核酸内切酶，能够水解核酸分子内磷酸二酯键的核酸酶。,一 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割,1简介 核酸限制性内切酶：是一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶 ，简称限制性酶。限制性酶分三型：、 型酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而型酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。型限制酶的限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲
2、基化酶,它修饰同一识别序列。,限制修饰系统简称 R/M系统 restriction modification,类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外来的DNA，并使外来的DNA降解。由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制性内切酶。当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化核酸序列是限制性酶无法作用的。,2型限制性内切酶的基本特性,型限制性内切酶的识别序列通常由48个碱基对组成，它们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的序列呈回
3、文结构。所以限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：（1）形成黏性末端 不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成的DNA限制片段具有黏性末端。,例如，Hind 切割结果形成5单链突出的粘性末端；而Pst 切割结果却形成3单链突出的粘性末端。（2）形成平末端 有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如Hpa切割结果形成平末端。Hind 的识别序列是： Hpa的识别序列是：5A AGCT T3 5G TTAA C33T TCGA A5 3C AATT G5,（3）限制片断末端的连接作用 许多种限制酶切割DNA
4、分子形成的短片断能够自发的重新环化起来。如果环化分子加热后又会重新线性化。但是，如果马上使用连接酶处理，使他们的3OH基团和5P基团之间封闭起来，环化就是永久的了。连接分为：分子间连接和分子内连接。,同裂酶和同尾酶,同裂酶是指一些来源不同的限制酶识别位点和切割位点的核苷酸靶序列完全一样。产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶对应一类限制酶，他们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。,例如:BamH和Bgl ,BamH的识别序列和切割位点： GGATC C C CTAGC,Bgl 的
5、识别序列和切割位点： AGATC T T CTAGA,相连后，其序列变为GGATCT CCTAGA， 与原来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不再为原来的酶所切割。,3. 影响核酸限制性内切酶活性的因素,（1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液,（1）DNA 纯度,污染在DNA制剂中的某些物质，例如：蛋白质、酚、酒精、异丙醇、EDTA、高盐离子等。所以 在纯化过程中，空摔一定要时间充足，要彻底；用微碱的TE洗脱；提高限制内切酶的用量；延长酶切时间；扩大酶切体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释。,（2）DNA甲基化的程
6、度,核酸限制性内切酶是原核生物限制修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈的影响酶的活性。通常从大肠杆菌细胞中分离的质粒DNA，都混有特定核苷酸序列的甲基化酶：1 Dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化。2 Dcm甲基化酶，催化ccatgg序列中内部的胞嘧啶残基的甲基化。所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大肠杆菌制备质粒DNA。,(3 )酶切消化反应温度,酶切标准温度是37，但是某些特殊的酶最适合温度是例外的，比如Sma是30。过高或者过低的温度会使内切酶失去活性。,（4） DNA的分子结构,DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。当D
7、NA分子为线性的时候最容易，当DNA分子存在二级结构的时候，酶切的活力就会大大降低。,（5 ）限制性内切酶的缓冲液,缓冲液一般的组成部分包括：氯化镁、Tris-Hcl,巯基乙醇或者二硫苏糖醇（DTT），牛血清蛋白（BSA）等。适合的二价金属离子浓度,通常为Mg离子。 适合的PH 通常为7.4左右。,限制性内切酶的星号活性,类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因此第二活性又称
8、星号活性。概括起来，诱导星号的因素有以下几种：1,高甘油含量(5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高(100u/ug DNA)；3,低离子强度(25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）,二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接,核酸限制性内切酶将DNA分子切割为不同大小的片断，然而要将不同来源的DNA片断组成新的杂种DNA分子，还必须将他们彼此连接并且封闭起来。,1DNA连接酶,能够催化两个双链DNA片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切
9、口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接，是一种吸能反应，需要能源物质NAD+或者ATP。DNA连接酶并不能连接两条单链的DNA，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。即封闭DNA缺口上的缺口 nick，而不能封闭裂口gap 。DNA连接酶主要有两种：一种是T4DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。,机理： 1、ATP（NAD）与酶结合产生 EAMPppi 即E(酶)ATPEAMPppi大肠杆菌DNA连接酶，E(酶)NAD+EAMP NMN（烟酰胺单核苷酸）,2、EAMP上的AMP转移到DNA的 5PO4上使其活化 3、活化的5PO4与相邻的3OH作用形成35磷酸二酯键，并
10、释放出AMP。但连接酶不能连接单链，必须要有模板的存在。也不能连接3OH和5PPP以及DNA与RNA。在后滞链的合成，DNA损伤的修复，重组及转座中DNA连接酶都发挥着重要的作用 。,影响连接效率的因素： A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值 E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。,2几种连接方式,A 用粘性末端DNA片断的连接 B 平端DNA片断的连接,A 用粘性末端DNA片断的连接,用特定限制性内切酶酶切过的质粒载体与以相同酶酶切过的具有粘性末端的DNA片断连接。载体可能自发的环化，这时可以用碱性磷酸酶处理酶切过的质粒载体，
11、移去末端的5磷酸基团，这样质粒载体就不能自发的环化了。而DNA片断在与这种载体连接后，会留下一个3-OH和5-OH的缺口，这种情况下仍然可以导入宿主菌。这种分子在宿主菌中完成缺口的修复。,B 平端DNA片断的连接（1） 直接用T4ligase连接（2） 同聚物加尾法（3） 衔接物连接法,（1）直接用T4ligase连接,提高平末端连接效率常用措施提高T4DNA连接酶浓度；提高DNA片段浓度；降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合；加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA的静电排斥力；加浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、强水化物三氯化六钴等。,（2）同聚物加尾法,末端脱氧核苷酸转移酶，它能够将核苷酸加到 DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上。当只加入DNA，dATP和末端脱氧核苷酸混合反应物时 产生poly A的尾巴。 加入dTTP 产生poly T尾巴。 这样两个用互补基团延伸过的DNA和载体，就能连接在一起（相当于有了个粘末端）。,（3） 衔接物连接法,衔接物：指合成的两条互补的寡核苷酸，使其配对后一端为平末端，另一端为为黏性末端，或两端为不同的黏性末端的片段。衔接头可以使DNA片段的平末端转变为黏末端，或由一种黏末端转变为另一种黏末端，并且无需用限制酶切。例如：EOCRI-SMAI平末端衔接物 5AATTCCCGGG3 3GGGCCC5,
