1、质粒 DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转 载 质粒 DNA 酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用 CaCl2 制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法5、掌握 互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒 DNA 的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对 DNA 分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。限制性核
2、酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等 DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。DNA 连接酶催化两双链 DNA 片段相邻的 5-磷酸和 3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的 DNA 连接酶是来自噬菌体的 DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的片段；2、连接双链 DNA 分子间的平端；3、在双链平端的 DNA 分子上添加合成的人工接头或适配子。目的 DNA 片段与载体 DNA 片段之间的连接方式（以 T4DNA 连接酶为例）主要有以
3、下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割 DNA 分子，形成 14 核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源 DNA 用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组 DNA 分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。（二）、平末端的连接载体分子和外源 DNA 插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割 DNA
4、 分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源 DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的 DNA 片段，PCR 扩增的和化学合成的 DNA 片段或由 RNA 为模板反转录合成的 cDNA 片段，也不会具有互补的粘性末端。理论上任何一对 DNA 平末端均能在 T4DNA 连接酶催化下进行连接，这给不同 DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的 5磷酸基团或 3羟基与另一个平末端的 3羟基和 5磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的 1/101/100。为了
5、提高其反应活性，一般选择 16较为合适。外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组 DNA 分子，重组 DNA 分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术上讲是能摄取外源 DNA 并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况
6、下，受体细胞的选择应符合以下基本原则：（1）便于重组 DNA 分子的导入；（2）能使重组 DNA 分子稳定存在于细胞中；（3）便于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分
7、要求即可。原核生物细胞: 是较为理想的受体细胞类型，其原因是：（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源 DNA 进入；（2）没有核膜，染色体 DNA 没有固定结合的蛋白质，为外源 DNA 与裸露的染色体 DNA 重组减少了麻烦；（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和 cDNA 文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体菌的原核生物
8、有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。体外连接的 DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。转化方法：重组质粒 DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离 DNA 片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合
9、到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：（1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单链 DNA 转化因子的整合；（5）转化子的形成。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的 DNA 分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒 DNA 分子的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是 Ca2
10、诱导的大肠杆菌转化法。Ca2 诱导的转化：细菌处于容易吸收外源 DNA 状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细菌内。其原理是将处于对数生长期的细菌置于 0，CaCL 2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时 Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入 DNA，Ca 2 又与 DNA 结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase ）的羟基 -磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上
11、。经短暂的 42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。 Ca 2 处理的感受态细胞，一般每微克 DNA 能获得 10510 6个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状 DNA 分子比线性 DNA 分子的转化率高 1000 倍。转化子的筛选以及鉴定：在重组 DNA 分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组 DNA 分子，一般仅有少数重组 DNA 分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组 DNA 分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被
12、转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组 DNA 分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源 DNA片段形成非期待重组 DNA 分子导入所致。因此，如何将被 转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来，然后进一步检测到含有期待重组 DNA 分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。通常我们将导入外源 DNA 分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA 分子的转化子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。在构建基因工程载体系统时，载体 DNA 分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转
13、染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用 LB培养基，在 LB 培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体 DNA分子上携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等，相应的筛选（选择）方法包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选等。在本实验中利用的是麦康凯培养基，用来筛选重组子。质粒
14、PUC19 进入 E.coliDH5后，通过 -互补作用，形成完整的 -半乳糖苷酶。在麦康凯培养基的平板上，转化子利用 -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，PH 降低培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。而含有外源基因片段的 PUC 质粒进入受体细胞后，不能形成互补的-半乳糖苷酶活性而出现白色菌落，这样根据这个条件即可筛选重组子。实验材料以及仪器PUC19 的质粒、LB 培养基、麦康凯培养基 提取质粒试剂盒恒温振荡培养箱，高速离心机，旋涡振荡器，水浴锅，酒精灯，微波炉，天平，电子天平，分析天平，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf 管，
15、塑料薄膜，微量移液器，手套，记号笔。 LB 培养基，抗生素氨苄青霉素(50ug/L)，TAE 电泳缓冲液(10 )，琼脂糖，50TAE 缓冲液，溴化乙锭(EB)， DNA 相对分子质量标准物 DNA Marker kHind 实验步骤1 准备阶段1.1 培养基的制备 LB 培养基 麦康凯培养基1.2 枪尖的准备 1000 ul、200 ul、20 ul 的枪尖在枪尖盒内装好，贴上标签1.3 EP 管的准备 在三角瓶内装好，不要装得太满1.4 准备好之后集体灭菌，备用2 实验阶段2.1 酶切2.1.1 Puc19 的质粒 DNA 酶切体系：8.7 uldd H 2O 、4 ul PUC19 质粒
16、DNA、1.5 ul 10Buffer 、0.8 ul Hind。2.1.2 按上述的顺序将酶切体系加好，混匀，置于 37的水浴锅内 2h。2.2 制备感受态细胞（无菌条件）2.2.1 将事先已经培养好的 OD 值为 0.5 左右的大肠杆菌的菌悬液置于冰上，备用；2.2.2 取出三个 EP 管，在酒精灯上将菌悬液加到三个管中，每管 1.5ml；2.2.3 之后再离心，5000rmp5min,离心之后将上清液倒掉（在酒精灯下）2.2.4 之后再在每管中加入 1.5ml 的菌悬液，离心，倒掉上清液；2.2.5 加入 800 ul 的 CaCl2混匀，之后冰浴 5min；2.2.6 离心 5000r
17、mp5min，倒掉上清；2.2.7 加入 100 ul 的 CaCl2，混匀即可，之后放置在-4冰箱中备用，或者在冰盒中。2.3 麦康凯培养（无菌条件）2.3.1 将已经灭好菌的液体麦康凯培养基放置在室温下；2.3.2 在大约培养基的温度与手背的温度差不多时，加入 ul 的氨苄青霉素（先预热再将氨苄青霉素打入培养基中）；2.3.3 倒平板，大约每个平板 20ml；2.4 连接2.4.1 连接体系：9 ul 的 dd H2O、3ul 的 digested PUC19DNA、5ul 的digested 噬菌体的 DNA、2ul 的 10Buffer、1ul 的 T4连接酶。2.4.2 按照上述顺序
18、依次加入，混匀，16的水浴锅，连接过夜。2.5 转化2.5.1 在三管感受态细胞中分别加入 5ul 连接液、0.5ul 的 puc19 质粒、空白；2.5.2 混合均匀，42热击 90s（时间要准确计时）；2.5.3 之后置于冰上，再在每管中加入 600ul 的新鲜的 LB 培养基；2.5.4 摇床震荡培养 1h。2.6 涂布2.6.1 按照以下的表格中显示的涂平板（无菌条件）2.6.2 在平板上做好标记，之后在 37下培养。含量类型20ul50ul 100ul 200ul含有连接液（Amp）1 个（+）2 个（+）2 个（+）1 个（+）含 puc19 质粒 1 个 (Amp) （-）空白(
19、Amp) 1 个（-） 不含 Amp 的平板 1 个（+）涂布验证表格（“+”表示红色菌落的多少，“”表示没有红色菌落）2.7 涂布观察2.7.1 观察平板上菌落的生长情况：2.7.2 记录情况如上，其中不含 Amp 的平板上培养基变黄；2.7.3 在含有 Amp 的平板上涂有连接液的平板上可以看到白色的菌落，这就是我们所需要的连接上的重组子形成的菌落，挑选红色菌落中的单独的白色菌落进行划线培养；2.7.4 用牙签轻轻挑去白色菌在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上划线，尽量将平板合理利用，不要将培养基划破；2.7.5 做好标记，继续培养。2.8 验证2.8.1 用接种环挑取平板上单独的大的白色菌落
20、在液体培养基中（菌落的选择一定要适当，这对于后面的验证很重要）；2.8.2 挑取两管菌液，做好标记，37振荡培养过夜；2.8.3 用试剂盒提取质粒：2.8.3.1 在两个 EP 管中各加 1.5ml 的菌液，10000rmp1min，之后倒去上清， 在各加 1.5ml 菌液离心（两管菌液不要混用，可以看做两种质粒）；2.8.3.2 吸取上清后，加入 250 微升的溶液，充分振荡混匀，使细胞悬浮；2.8.3.3 加入 25 微升溶液，请求那个翻转倒置数次，直到获得透明的裂解液；2.8.3.4 加入 350 微升的溶液，立即翻转倒置数次至有絮状沉生成；2.8.3.5 之后离心，10000rmp10
21、min，吸取上清于离心柱中，离心10000rmp1min，弃收集管中的液体；2.8.3.6 在离心柱中加 500 微升的 BufferHB，离心 10000rmp1min，弃收集管中的收集液；2.8.3.7 在离心柱中加入 700 微升的 Wash Buffer，离心 10000rmp1min，弃收集管中的收集液；2.8.3.8 空离心柱再离心 13000rmp2min；2.8.3.9 将离心柱取出置于 1.5ml 的 EP 管中，加入 40 微升的Elution Buffer,将液体加在离心柱的孔中，静置 2min,之后离心13000rmp1min;2.8.3.10 将离心柱取出，将 EP
22、管中的质粒 DNA 放好，做好标记；2.8.4 重组质粒 DNA 的酶切2.8.4.1 重组质粒 DNA 的酶切体系：4.5 ul 的 dd H2O，4ul 的重组质粒DNA，1.0ul 的 Buffer，0.5ul 的 Hind；2.8.4.2 按照上述的顺序，一次加入，混合均匀，置于 37的水浴锅内 1h;2.8.5 电泳2.8.5.1 在所得的酶切液中加入 3 微升的 Loating Buffer,混合均匀点在胶孔中，点上相应的 Hind的 marker；2.8.5.2 在 EB 中染色 10min 左右在紫外灯下观看实验现象，分析条带；实验结果1 2 3重组质粒 DNA 酶切电泳图结果
23、分析：在上图中自左向右第七泳道即为 marker 带，分为多条带，在 marker 的右侧的两个带即为我们组所提取的质粒 DNA 的酶切带：其中 1 为所连的目的基因，大约是2.0kb 左右的大小，2 为载体，条带的大小大约为 2.8kb，3 为所连的目的基因，条带的大小大约为 6.5kb 大小。这两种质粒酶切之后的结果相同，说明连接的目的基因是相同的，至少在大小上是相同的。由于是单酶切，所以重组质粒连上的不一定是单片段，可能是单片段单拷贝、单片段多拷贝或是多片段插入等。一般来说较大的片段不易完成连接和转化。在连接方面，载体和片段没有足够的完整接触的机会，且连接上的大片段对整个重组载体的生长状
24、态会有比较大的影响，同时，大质粒的转化相对比小质粒效率低一些，这个在图中就可以看到，几乎没有较大的片段，主要集中在载体附近。注意事项1.限制性核酸内切酶的酶切反应应属于微量操作技术，无论是 DNA 样品还是酶的用量都很少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系。2.注意酶切加样的次序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和 DNA，最后加酶。前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下，并充分混匀。酶液使用完毕后立
25、即放回冰箱，防止酶的失活。3.注意盖紧 Eppendorf 管的盖子，防止水浴加热的过程中水汽进入管内，并注意做好标标记以防样品混淆。4.为了提高连接效率，一般采取提高 DNA 的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA 自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其 5末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后的却口可在转化细胞后得以修复。5.勿将含有 DNA 的凝胶长时间暴露在紫外灯下，减少紫外线对 DNA 造成的损伤。要回收 DNA 时，尽可能采用长波长的紫外灯(300360 rim)。切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对 DNA 造成损伤。 6.涂布时先将涂布棒蘸取酒精，再在酒
26、精灯火焰上烧三遍，烧时酒精会引燃，注意安全。7.为了节省涂布时间，可以先涂第一组的不含氨苄的，然后是含有氨苄的，然后是第二组，这四块平板可以一块涂。第三组的可以一块涂，但是要注意从低浓度到高浓度涂布。8.涂布时，一定要等培养基凝固完全后再涂。9.酶切、连接及转化等涉及微生物部分的实验要注意无菌操作，涉及分子实验的部分虽然不用无菌，但要注意不要污染杂质。实验小结质粒的酶切、连接、转化、重组子的筛选及质粒的提取等操作通过一系列实验有了进一步的了解。学会了分析琼脂糖凝胶电泳所反应出来的信息，如看片段大小、连接结果的分析等。通过这次一系列的实验，熟悉分子实验的基本操作技术，在平时的学习中学到的很多分子生物学和基因工程的知识都得到了应用，这些操作中的注意事项都有了了解。现在，经过学习，最有收获的就是相信等做完了后面的实验，自己就可以进行一系列简单的分子实验了。
