1、限制性内切核酸酶消化DNA、从琼脂糖凝胶中回收DNA及载体与目的基因的连接,掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法 掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法 掌握如何构建体外重组DNA分子及DNA的连接方法,实验目的,限制性内切核酸酶消化DNA,限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上特意核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。,限制性内切酶能识别，结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，并在该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二
2、酯键，切断DNA双链结构。限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为46个核苷酸，具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列 ）特征。限制性内切核酸酶消化产生的DNA末段分为5粘性末端，平末端，3粘性末端三大类。末端的5端为磷酸基团（-P)，3端为羟基基团(-OH)。这些末端结构可能影响其它酶（如连接酶）的反应效率，应特别注意。,原 理,在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是Hind和EcoR，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。,酶切体系,10M : 2mlHind : 1mlEcoR: 1mlddH2O : 6ml质
3、粒 ： 10ml总体积 : 20ml,将酶切体系按顺序加好后放入已预热的37C 的水浴锅中，使反应体系在这个温度下进行酶切。 酶切2h后加2ml 10loading buffer终止酶切反应，取全部的样品用于胶回收。,试验中用到的两种酶的缓冲液,Hind: EcoR: M Buffer H Buffer 对于Hind来说，在含有 M Buffer 时的酶切效率最高；而对于EcoR来说，在H Buffer里面的酶切效率高；但在两者同时进行酶切时，在M Buffer里时的效率最高。因此本实验中我们用M Buffer来进行Hind和EcoR的双酶切。,从琼脂糖凝胶中回收DNA,在酶切的过程中，除产生
4、我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。,琼脂糖凝胶回收：,原理：不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳动速度不一样而分离，通过回收可用于后续实验。NaI存在条件下，加热至55，含有DNA片段的琼脂糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子，从而得到纯净的DNA片段。硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，使用弱碱溶液如TE(pH8.0)等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段。,1. 取一干净
5、的1.5ml的离心管，称重，标记。2. 紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段的DNA凝胶，放入已称重的离心管中，称重。3. 按每100mg琼脂糖凝胶加入400ml binding solution的量添加solution至装有凝胶的离心管中。5060放510min融胶。4. 将以上溶液转移至Genclean柱中，室温放置2min，6000rpm室温离心1min。将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离心一次。弃收集管中的废液。,操作步骤,5. 往上述管中加入500ml wash solution，12000rpm，1min，弃废液。6. 重复步骤5一次。7. 将Genclean柱放回收
6、集管中，12000rpm ，1min，彻底去除wash solution。8. 将Genclean柱放到一干净的1.5ml的离心管中，加入30ml Elution buffer,37 放置2min, 12000rpm,1min.所得液体即目的片段。9. 取5ml目的片段，加入1ml 6loading buffer，电泳鉴定。剩余液体可直接用于后续试验或-20 保存。,注意事项,电泳所用的胶的浓度为1%，胶经冻融后，孔径较大，利于挤压。溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。在切胶时，要注意尽量沿目的片段的边缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。,DNA的重组连接,原理：DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA，通过DNA连接酶催化两双链DNA片段组邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。本实验利用T4DNA连接酶，有Mg2+,ATP存在的连接体系中，将载体pUC18与目的基因连接起来。,连接体系,DNA ： 7ml载 体 ： 1mlT4 Buffer : 1ml T4DNA Ligase: 0.5mlddH2O : 0.5ml总体积 ： 10ml,(所需要用到得酶及缓冲液均需冰浴，以防蛋白变性),
