1、第六章 目的基因筛选与DNA文库的构建,目的基因的获得,基因文库（gene library）； 从物种的基因组或cDNA中PCR 扩增；人工合成基因。,准备要分离、改造、扩增或表达的基因,基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。即 Genomic library,基因组 DNA 文库：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。,
2、按照外源DNA的片段：基因组 DNA 文库和cDNA文库,包含基因的全部信息，如编码区，非编码区，内含子和外显子、启动子及调控序列,cDNA文库:complementary DNA 互补DNA由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库。,反映了基因表达普，对研究基因表达，调控及基因互作非常有用。,基因组 DNA 文库的构建程序： 1、载体的制备； 2、高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； 3、HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分
3、离（PFGE size selection）； 4、载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 5、重组克隆的挑取和保存。构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。,文库的代表性和随机性,代表性文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。采用酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等；增加文库总容量。,外源片段大小和重组克隆数量,1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1
4、-p)/ln(1-f)n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值,哺乳动物 3109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3109 n=690773.2,E.coli 4，639，221bpp=99% f=20kb/4600kb n=1056.9,p=99% f=10kb/4600kb n=2116,一、用于构建基因文库的载体,第一节 基因组DNA文库的构建,可装载的外源DNA Plasmid 10kb Phage 0-23kb Cosmid 45kb BAC 100kb YAC
5、 300kb-1.2Mb,粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半，如需700000时，cosmid需350000个。,噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过 100kb 以上的外源片段。,YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段BAC 可减少DNA分子间的重组,置换型载体,cos,cos,R,L,Central stuffer,1 phage vectors,目前用EMBL系列, 2019，DASH， Charon 38-40，GEM-11 等置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb,有利于分子
6、杂交进行筛选,43kb ，左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。,2Cosmid vector（柯斯质粒）,由噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因,所有cosmid vector均可用于构建文库。,cos序列：噬菌体DNA的包装序列,T4噬菌体DNA连接酶,多连体分子,二、用phage构建文库1总DNA的提取 DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb（cosmid200kb）,2载体臂的制备 购买 载体制备、纯化 限制酶消化 BamHI / EMBL X
7、hoI / GEM-11,载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖 或NaCl）梯度离心的收获量大，而agarose回收量小回收无填充片段聚乙二醇沉淀，除去碎片,置换型载体,cos,cos,R,L,Central stuffer,3基因组DNA的消化一般采用Sau3AI消化回收20-24kb （ agarose法 or 梯度离心）有些载体可做不完全补平,4连接/包装连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4 6个月稳定）,5扩增和保存 重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选6在宿主菌上形成噬菌斑7带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8对选出的重组p
8、hage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析,载体的去磷酸化，提高连接和包装效率,双酶切消化载体（EMBL系列，2019，XDASH，Charson 40,35,34）EMBL 3A: SalI BamHI EcoRI - E1 B1-S1,连接反应中，应测定外源片段与载体的比例 phage 108pfu/g DNA,若用BamHI和EcoRI双酶切，可用异丙醇沉淀或其它柱层析法去除小片段，使非重组体的数目降低2个数量级，结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级,基因组DNA片段3凹端的不完全补平,-GATC- -CTAG-,- GATC- -CTAG -,Sau3AI,-GA GATC
9、- -CTAG AG-,Klenow,dATP /dGTP,-CTCGAG- -GAGCTC-,XhoI,Klenow,dCTP /dTTP,-CTC TCGAG- -GAGCT CTC-,互补,GEM-11,基因组DNA,Vector,三、重组体的筛选和分析噬斑原位杂交,将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上,要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物基因组复杂度为3109bp，必须筛选几十万个噬斑,不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目,. 杂交筛选 用探针 . 纯化 . 分析 /Southern杂交，酶切Sequencing/其它方法，如免疫学方法,四、亚基因组文库的构建用基因组
10、DNA的特定部分所构建的基因文库 质粒 DNA，线粒体DNA, 特定限制性片段,在有杂交探针的情况下，可通过Southern杂交，先找出目标基因所在的限制性片段的大小，然后用相应大小的限制性DNA片段构建出基因文库，这样可减少筛选的压力。,例如 将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，通过Southern杂交,则 将SpeI切割的基因组DNA中的8.3kb片段回收，用于构建DNA文库,发现目标基因在8.3kb SpeI片段上,哺乳动物 3109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2,E.coli 4639221bp p=99% 平均10kb n=2134,若用占 总DNA 1/1
11、0 区域的限制性片段, 则 n = 69075,若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段(10kb)， 则 n = 199,一、cDNA克隆用的mRNA,第二节 cDNA文库的构建,1. mRNA的完整性,指导合成高分子量蛋白质的能力无细胞翻译体系（源于网织红细胞）哺乳动物总mRNA可编码 10100kDa蛋白指导合成目的多肽的能力利用免疫沉淀和SDS-PAGEmRNA的大小500bp8kb 大部分 1.52kb,总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力 合成的cDNA也应为上述范围脱氧胸苷酸12-18聚体oligo(dT) 12-18 引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至
12、少增加30倍,2mRNA的丰度高丰度mRNA珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白在特定细胞中占50-90%,低丰度mRNA 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA,文库应足够大，鉴定和分离困难,3mRNA的富集按大小对mRNA进行分级分离分离不同大小的mRNA（先变性，如氢氧化甲基汞，后梯度离心，蔗糖）体外翻译，检测每份中的比活,cDNA的分离级分离 近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA, agarose分离大小易辩,多聚核糖体的免疫学纯化法 用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体 免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spha
13、rose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo(dT)层析分离mRNA。 此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05% 并非都可用，根据材料来源特异性来选择,反转录酶 AMV (42) M-MuLV (37)RNase H RNase H弱 长mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求浓度高模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 RNase 抑制剂,AAAAAAA,mRNA,5,3,TTTTTTTT,二、cDNA第一链的合成,cDNA,1自身引导法,三、cDNA第二链的合成,2. 置换合成法,有效无须进一步纯化不需用S1酶，否则会导致cDNA的大量损失,问题：
14、如何脱帽以便进入载体5端cDNA不能合成（少几个Nt）有可能仍形成发夹结构,3. 第二链引导合成,Okayama-Berg方法,4. 引物-衔接头合成法,四、ds cDNA的分子克隆,1.同聚物加尾,问题：只对质粒有效，文库不易保存和复制。尾的长短不一 (100dA/dT, 20dG/dC)同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。,2合成接头和衔接头,cDNA,合成接头 (含酶切位点),酶切,NotI, SalI,与载体连接,Optional: methylation,接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次),先甲基化ds cDNA，再连接接
15、头,用衔接头替换接头,用衔接头替换接头,3. 其他方法,(1) mRNA-cDNA杂交体克隆,mRNA,cDNA,AAAA,AAAA,RNA 末端加尾效率 只及DNA的1/10,合成第一链后, 加尾, 与带dT尾的载体退火, 在宿主体内, 可除去RNA, 代之以DNA,优点: 无须合成第二链, 序列完整 但效率 1/10,(2) 依次连加 不同接头,(3) RACE random amplification of cDNA ends,cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆 筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆， 而RACE可产生大量独立克隆,mRNA,c
16、DNA,TTTTTTTT-QI-QO,AAAAAAA,A. 经典RACE,3末端克隆,TTTTTTTT-QI-QO,反转录,QO,PCR,GSP1,QI,GSP2,根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物 GSP1,和GSP2,PCR,cDNA克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法获得3末端和5末端的序列,5末端克隆,mRNA,AAAAAAA,GSP1,GSP1,AAAAA,Q1-Q2- TTTTTT,Q1/ GSP1 PCR,反转录,Q2/ GSP2 PCR,GSP2,获得的cDNA 克隆片段,AAAAAAA,GSP1,反转录,连接RNA寡聚物,NNNNNNNN,B. 新RACE,
17、(4) 其他与cDNA第二链合成有关的方法，如Okayama-Berg方法和引物-衔接头合成法,五、cDNA克隆用的载体,1gt10和gt11 gt10: 可用核酸探针 克隆0-6kbEcoRI 插入后载体变cI-cI+在hflA中发生溶原,GenBank: U02447,gt11：表达载体，可用免疫探针克隆0-7.2kb 可表达融合蛋白LacZ,E.coli C600 allowing growth of parental and recombinant phage C600hfl represses parental phage growth 50-100-fold, recombinan
18、t phage form clear plaques and parental phage form turbid plaques,E.coli LE392 allowing growth of parental and recombinant phage Y1090 as the host, 42C形成噬斑,适合用免疫学探针筛选,2. ORF89kb 可用于定向克隆,3其它gt18，19，20，21，22，23，ZAP,第三节 基因克隆的策略,基因克隆的本质 从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”,常见筛选工具: 探针,狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段,抗性基因: antibi
19、otics抗性基因, 抗重金属活性,一、功能筛选,分解基因: 苯环化合物, 分解酶,功能活性：杀虫，酶,启动子/复制子,利用目标基因的特定功能进行筛选,Amp ori,MCS,Tet gene without promoter,Vector,将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter,其他标记: gfp, Kan,质粒复制单位的克隆,Amp ori,MCS,目标宿主可用的 抗性gene,将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位,功能缺失,在获得相应突变体的前提下 以此突变体作为宿主 在野生型的DN
20、A导入后检测回复突变,如 营养缺陷型 相关的基因,二、核酸探针,同源DNA探针,高度保守的基因 rRNA基因,邻近种属的相应基因,相应基因的序列比较,合成寡核苷酸,蛋白质N-末端aa序列,简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列,综合合成,可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针,根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针,设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交,三、免疫 在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选,四、高表达基因高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数,五(1)、差别杂交,五(2)、扣除杂交
21、,T cell (TCR),B cell,mRNA,mRNA,cDNA,cDNA: mRNA 杂交体,过量,通过羟基磷灰石柱, 吸附杂交分子,T cell (TCR)特异的cDNA 流出,cDNA 第二链合成,生物素标记,生物素结合蛋白柱,六、mRNA差别显示,mRNA 3末端 有12中可能的序列,以此12种引物引导cDNA第一链合成,引物: 5-T11MN 或5-T12MNM=A, G, or C,以10核苷酸随机引物引导cDNA第二链合成(PCR)可产生50-100条100-500bp DNA条带,12种锚定引物和20种随机引导组成240组引物, 产生约20000 DNA条带,Sequen
22、cing gel,对两个相近品种的mRNA作上述处理, 比较它们产生DNA扩增条带的差异, 找到 单方具有的特异DNA条带, 则可能找到特异性表达的基因, 回收并克隆特异性的条带, 分析其序列, 以此条带为探针克隆全长基因。,七、酵母双杂交系统,用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因,GAL4蛋白： 酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录,GAL4蛋白：可分为两个区域DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aaAD: 转录激活域， C-末端 768-881aa,融合蛋白：DNA-BD域 / X蛋白,X蛋白与
23、靶蛋白Y 可发生作用,构建融合表达文库 AD域 / cDNA,host,当文库中的某个重组子装载有蛋白Y的cDNA时，可能启动LacZ(HIS)报告基因的表达,Invitrogen Hybrid Hunter,五、其它Tn插入缺失分子标记（略）,六、PCR在cDNA克隆中的应用,1. RACE 等,获得的cDNA 克隆片段, 并补平末端,2、cDNA第二链的扩增,CCCC,AAAA,TTTTT-,mRNA,AAAA,TTTTT-,-CCCC,AAAA-,TTTTT-,-GGGG,PCR扩增出ds cDNA,加入合成的引物,mRNA,mRNA,-CCCC,AAAA-,TTTTT-,-GGGG,用合成的引物 合成cDNA第一链, 加入polyC尾,3. PCR-Select cDNASubtraction,Clontech公司,
