1、 5.1 DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、基础知识一、基础知识（一）提取（一）提取 DNA的的 方法方法1.提取生物大分子的基本思路提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.提取提取 DNA的基本思路的基本思路提取提取 DNA，去除其他成分，去除其他成分利用利用 DNA与与 RNA、 蛋白质蛋白质 和和 脂质脂质 等等 在物理和化学性质方面的差异 DNA的溶解性的溶解性DNA和和 蛋白质等成分在不同浓蛋白质等成分在不同浓度的度的 NaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同 ,利用这一特点，选择适当的利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使盐浓
2、度就能使 DNA充分溶解，充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，成分溶解， DNA析出。析出。3.DNA等大分子的理化性质等大分子的理化性质 DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将于酒精。将 DNA与蛋白质进一步分离。与蛋白质进一步分离。 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶蛋白酶 水解蛋白质，水解蛋白质， 对对 DNA没有影响没有影响 高高 温温 大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受 60 80而而 DNA在在 80 以上才会变性以上才会变性
3、 洗涤剂洗涤剂 溶解细胞膜溶解细胞膜 ， 去除脂质和蛋白质去除脂质和蛋白质但对但对 DNA没有影响没有影响（二）（二） DNA的鉴定的鉴定沸水浴条件下，沸水浴条件下， DNA遇遇 二苯胺被染成二苯胺被染成 蓝色。蓝色。二、实验设计二、实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取从下列材料中选取 2 3种原则原则：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌凡是含有凡是含有 DNA的生物材料都可以考虑的生物材料都可以考虑选用选用 DNA含量相对较高的组织含量相对较高的组织要容易取得、细胞分散或容易分散、细胞容易破碎或要容易取得、细胞分
4、散或容易分散、细胞容易破碎或容易研碎、细胞核中的容易研碎、细胞核中的 DNA容易释放。容易释放。（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含 DNA的滤液的滤液1、动物细胞、动物细胞 容易破碎容易破碎鸡血细胞溶液：鸡血细胞溶液：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液。收集滤液。蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出 DNA。2、植物细胞、植物细胞 需要溶解细胞膜需要溶解细胞膜 加入一定的洗涤剂和食盐加入一定的洗涤剂和食盐 充分的充分的 搅拌和研磨，过
5、滤后收集研磨液搅拌和研磨，过滤后收集研磨液洗涤剂洗涤剂 离子去污剂，能溶解细胞膜，利于离子去污剂，能溶解细胞膜，利于 DNA释放释放食食 盐盐 NaCl，利于，利于 DNA的溶解于研磨液中。的溶解于研磨液中。研磨不充分，研磨不充分， 核内的核内的 DNA释放不完全，提取的释放不完全，提取的 DNA量少，量少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。为了纯化提取的 DNA需要将滤液作进一步处理。讨论：滤液讨论：滤液 /研磨液中可能含有哪些成分？研磨液中可能含有哪些成分？可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和 RNA等杂质等杂质1. D
6、NA的溶解性的溶解性2. DNA对对 酶酶 、 高温高温 和和 洗涤剂洗涤剂 的耐受性的耐受性（三）除去滤液中的杂质（三）除去滤液中的杂质利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的 DNA与蛋白质分开；利用 DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与 DNA分离。为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？（四）（四） DNA的的 析出与鉴定析出与鉴定与滤液与滤液 体积相等体积相等 的的 冷却冷却 的的 酒精溶液酒精溶液 (体积分数体积分数 95 )，静置静置 2 3min，溶液中会出现白色丝状物。，溶液中会出现白色丝状物。 粗提取粗提取 DNA1、 DNA的析出的析出用玻璃棒 沿一个方向 搅拌，
7、 （以利于 DNA分子的附着和缠绕） 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。2. DNA的鉴定的鉴定 向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液溶液 5ml 其中一支试管中加入其中一支试管中加入 DNA丝状物丝状物 各加入各加入 二苯胺二苯胺 试剂试剂 4ml 混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热 5min 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色观察你提取的 DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明 DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功，
8、如果不呈现蓝色，可能所提取的 DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备1、请解释提取 DNA的实验操作中主要的步骤的目的。（ 1） 材料的选取，其目的是一定要选取 DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；（ 2） DNA的释放和溶解，是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的 DNA全部溶解；（ 3） DNA的纯化，根据 DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将 DNA与杂质分开；（ 4）对 DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。共有 “ 三次过滤，两次析出，七次搅拌 ”加入 “ 两次蒸馏水， 三次 NaCl溶液 ，一次
9、酒精”方法步 骤 加入物 质 实验 原理及 现 象1.制 备鸡 血 细 胞液 柠 檬酸 钠 溶液 防止血液凝固2.提取 鸡 血 细 胞 细 胞核物 质 蒸 馏 水 使血 细 胞 过 度吸水而破裂3.溶解 细 胞核内的 DNA 2 m1 L的 NaCI溶液 DNA在高 浓 度 NaCI溶液中溶解度大4.析出含 DNA的黏稠物 蒸 馏 水 将 NaCl溶液稀 释 至 0.14mol/L， 使得 DNA最大限度地 释 出5.滤 取含 DNA的黏稠物 使含 DNA的黏稠物留在 纱 布上6.将 DNA的黏稠物再溶解 2 mol L的 NaCl溶液 同 37.过滤 含 DNA的 NaCl溶液 除去含 DN
10、A的 滤 液中的 杂质8.提取含有 杂质较 少的DNA 冷却的 95的酒精 50 mL DNA不溶于酒精，出 现 沉淀9.DNA的 鉴 定(1)向两支 试 管中各加入 2 mol L的 NaCl溶液5mL(2)将 丝 状物放入 A试 管中， 搅 拌使其溶解(3) 向两支 试 管中各加入4 mL二苯胺 试剂 。混合均匀后沸水浴 5minA出 现蓝 色 ， B无 变 化2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？提取蛋白质比提取 DNA的难度大。（ 1）与 DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、 pH等条件要敏感得多，很容易失活；（ 2）并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同
11、，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。一、基础知识一、基础知识（一）（一） DNA分子的结构分子的结构C、 H、 O、 N、 P1、组成元素、组成元素脱氧核苷酸脱氧核苷酸2、基本单位、基本单位3、脱氧核苷酸结构、脱氧核苷酸结构OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5335 碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图（二）（二） DNA的复制的复制2、时期、时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所、场所
12、 细胞核（主）、线粒体、叶绿体细胞核（主）、线粒体、叶绿体4、模板、模板 DNA母链母链1、概念、概念 由一个由一个 DNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的 DNA的过程的过程5、原材料、原材料 脱氧核苷酸脱氧核苷酸6、基本条件、基本条件 酶、酶、 ATP、 原料、模板原料、模板7、复制过程、复制过程 （半保留复制）（半保留复制） 边解旋边复制边解旋边复制8、遵循原则、遵循原则 碱基互补配对原则碱基互补配对原则9、复制的意义、复制的意义 使遗传信息从亲代传给了后代，使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。从而保持了遗传信息的连续性。（三）（三） PCR(多聚酶链式反应）多聚
13、酶链式反应）1、 DNA聚合酶聚合酶 特性特性不能从头合成不能从头合成 DNA， 只能从只能从 DNA的的 3 端开始延伸端开始延伸 DNA链，链，因此，因此， DNA复制需要引物复制需要引物2、 DNA聚合酶聚合酶 作用过程作用过程当引物与当引物与 DNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶聚合酶就能从引物的就能从引物的 3 端开始延伸端开始延伸 DNA链，链， DNA的的 合成方向总是合成方向总是从子链的从子链的 5 端向端向 3 端延伸端延伸3、 PCR原理原理 在在 80 100C 的温度范围内，的温度范围内， DNA的的 双螺旋结构将解体双螺旋结构将
14、解体，双链分开。，双链分开。 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的 DNA链链又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。 PCR利用了利用了 DNA的热变性原理，通的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。过控制温度来控制双链的解聚与结合。靶序列靶序列靶序列靶序列PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 53553533PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 53553533Taq DNA聚合酶聚合酶PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸
15、：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列第第 1个个 PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的：得到两个拷贝的靶序列靶序列利用 PCR技术扩增目的基因二、二、 PCR 的的 实验操作实验操作1、 PCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够 自动调控温度自动调控温度 的仪器的仪器2、微量离心管、微量离心管一种一种 薄壁塑料管薄壁塑料管 ，总容积为，总容积为 0.5ml3、微量移液器、微量移液器用于用于 定量转移定量转移 PCR配方中的配方中的 液体，液体， 其上的一次其上的一次性吸液枪头用一次更换一次性吸液枪头用一次更换一次一、基础知识蛋白质提取与分离的依据 :(蛋白
16、质的物化理性质 )形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。 提取分离方法凝胶色谱法 凝胶电泳法 1.凝胶色谱法 （ 1）原理： 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。（ 2）材料 :多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （ 3）分离过程 混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收 集大分子收 集小分子 洗脱： 从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如 H2CO3/NaHCO3， HC/NaC， NaH2PO4/Na2HPO4等（ 4）缓冲溶液洗脱剂组成：配制：作用：
17、调节酸和盐的用量，可配制不同 pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液 pH的干扰而保持 pH稳定。2凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质微粒 带电性质 （正电荷或负电荷） 、电量、形状和大小 不同，在电场中受到的作用力 大小、方向、阻力 不同，导致不同蛋白质在电场（或介质）中的 运动方向 和 运动速度 不同。思考 ： 蛋白质为什么带有电荷？在一定的 PH下 ，蛋白质可电离的基团会带上电荷决定运动方向电场作用 力介质中形成阻力决定运动速率电 荷性质电 荷量分子形状分子大小 2） 蛋白质分子在电场作用下运动的影响因素3）方法 :a.琼脂糖凝胶电泳 （如 PCR产物的检测）b.聚丙酰胺凝胶电泳 （测蛋白质分子量的方法）c.聚苯乙烯凝胶电泳如： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 “ 蛋白质 SDS复合物 ” ，使蛋白质 迁移速率仅取决于分子大小 。 二、实验操作样品处理和粗分离纯 化纯度鉴定血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放 血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白
