1、第十二章 原核生物基因表达的调控,本章学时数：3学时本章重点：乳糖操纵子模型,何谓表达？,表达涉及两个环节：转录、翻译. 基因工程中“高表达” high level expression， 即高的蛋白质产量。,基因的表达是受到调节控制的： 经济性 安全性 有序性,哪些基因被转录，转录的效率如何。,mRNA类型，mRNA数量。,蛋白质的类型，蛋白质的数量。,特定细胞的功能和属性。,细菌的乳糖代谢乳糖操纵子,一、酶的诱导与阻遏,1900年，Dienert首次注意到酶的诱导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种酶即消失.结论：底物的存在能
2、专一地诱导酶的产生。,当培养基中有乳糖（lactose），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。,乳糖（lactose）既是底物（substrate）又起到了诱导物（inducer）的作用。,1953年Monod发现酶的阻遏作用大肠杆菌培养基中的色氨酸阻遏了色氨酸合成酶的合成.同等诱导或同等阻遏:大肠杆菌合成色氨酸所需的酶，5个编码基因串联在一起，而且排列顺序也跟基因产物所催化的反应顺序相同。这种成串现象由Demerec等人于1955年首先观察到。,从1946年起及随后的10年，Jacques Monod、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及Andre
3、 Lwoff 对乳糖代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。,E.coli能以乳糖（葡萄糖-4-D-半乳糖苷）这种双糖作为唯一碳源。乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖.,与乳糖代谢有关的三种酶：-半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖；-半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿膜进入细菌细胞内。巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰辅酶A转移到-半乳糖苷上。三种酶的编码基因分别命名为lacZ 、 lacY和lacA，统称为结构基因，在染色体上相连在一起。,lacZ：,编码-半乳糖苷酶（-galactosidase）,四聚体，分解乳糖。,乳糖,半乳糖+葡萄糖,-半乳糖苷酶,lacY：,编码-半乳
4、糖苷透性酶（permeasae）。膜蛋白，将乳糖转运到细胞中。,lacA：,编码-半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。二聚体; 把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。,培养中C源不是乳糖时，三种酶在细胞内的含量很低，只有几个分子或不到。如果用乳糖代替葡萄糖，则在几分钟内，每个cell转录出30-50个mRNA模板，产生3000多个-半乳糖苷酶分子，另两种酶的量也迅速增加，一旦乳糖耗尽，三种酶的合成同时停止。这里，乳糖被当作诱导物，并被-半乳糖苷酶催化分解，一些不能被该酶分解的半乳糖苷也可作为诱导物，如IPTG （异丙基-D-硫代半乳糖苷）IPTG有诱导效应而本身不被分解，称
5、为安慰诱导物(gratuitous inducer),constitutive不需诱导、持续地合成.诱导型的合成（如-半乳糖苷酶也可能产生组成型突变体mutant）乳糖操纵子模型有关的试验中，利用了：组成型突变体部分二倍体技术（性导, F因子）,组成型合成,Joshua Lederberg为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac -），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：Z-Y-A,乳糖操纵子模型,同时发现它们是被同时诱导转录的。,雅科Jacob和莫诺Monod根据试验事实提出了操纵子模型operon model。认为这三个酶的基因转录受一个开关单位的控制。,操纵子模型（Op
6、eron Model）,1960年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negative control）。,获1965年Nobel生理学和医学奖,操纵子模型对乳糖诱导效应的解释,LacI 编码了一个阻遏物(repressor)，与结构基因附近的一个“假想”位置（命名为operator site）结合, 从而抑制结构基因的转录。,该阻遏物能变构（allosteric）。即 它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了 与operator DNA结合的能力，结构基因 才能够转录表达。,调节基因编码的产物是一种蛋白质分子，称为阻遏物。当培养基内没有乳糖时，阻遏物结合到操纵基
7、因上，阻止了RNA聚合酶的通过，所以结构基因得不到转录。培养基加入乳糖后，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏物的构象改变。阻遏物的构象改变后，失去了与操纵基因结合的能力，阻遏物从操纵基因上解离下来。于是转录得以进行。,Jacob和Monod未提出启动基因区（RNA聚合物识别并结合的区域）P（Promotor，又叫启动子） ,后来由伊彭提出。,启动子：由两个盒组成，以转录起始点为+1，-35的TTGACA盒是RNA聚合酶的识别位点，-10的TATAAT盒（Pribnow盒），是RNA聚合酶的结合位点。这样，操纵子的概念：最初的操纵子=操纵基因+结构基因，进一步成为操纵子包括：启动基因+操纵基因
8、+结构基因。,操纵子（operon）: 功能相关的结构基因在染色体上成簇（cluster）排列, 由一个共同的控制区调控基因的转录,是原核生物转录调控的基本单位.由结构基因（structural genes）和上游相邻的控制区（regulatory region）组成。,一个操纵子转录后形成一个多顺反子mRNA(polycistronic)。,对模型的遗传学验证,组成型突变（constitutive mutants）,没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。,遗传作图发现：,这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在结构基因的上游（operator region）。,另一个组成型突变（lacI-）
9、作图的结果是在离结构基因不远处。,野生型,组 成 型 突 变,lacOc,lacI-,根据操纵子模型的原理，可以预测：,模型预测,1. lacI基因产物是个可扩散的（diffusible）蛋白。,2. O区（operator region）在调节过程中起作用，但不编码产物。,3. O区必须紧靠结构基因。,实验验证,Pardee、Jacob、Monod设计了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。,1. 实验原理,2. 实验过程,通过F因子，给lacI-或lacOc的突变菌输入野生型lacI或lacO基因，观察其对-半乳糖苷酶活性的影响。,实验1：,组成型突变 lacI- lacZ+,F菌株
10、 F lacI+ lacZ-,乳糖诱导型菌,说明F菌株的lacI+能弥补原菌株的lacI-缺陷。,即：lacI 对lacZ是反式作用（trans-acting）。,组成型突变 lacI+ lacOc lacZ+,F菌株 F lacI+lacO+ lacZ-,组成型表达,实验2：,说明F菌株的lacO+不能弥补原菌株的lacOc缺陷。,即：lacO对lacZ是顺式作用（cis-acting）。,实验3,lacI超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在O区的DNA上，使lacZ不能表达。,野生型 lacI+ lacZ+,F菌株超突变 F lacIs lacZ+,组成型不表达,
11、说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的O区。,利用超突变：,操纵子模型的意义,Jacob和Monod1961年发表的操纵子理论是遗 传学的的一个里程碑（landmark）。,用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。,暗示了蛋白质与DNA结合的概念。,描述了“阻遏物”的调节因子概念（尽管当时并不知道它是蛋白质还是RNA）。,当时人们刚知道mRNA，对转录的细节一无所知！,附：阻遏物的分离和鉴定,阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。,直到1966年，Walter Gilbert和Benno Muller-Hill从lacI的超量突变菌株中，利用透析（dialysis）的方法
12、，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。,Gilbert及其同事又用放射自显影证明它能与lacO DNA结合。, 分离,鉴定,放射性标记的阻遏物能与野生型O区结合,放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合,Lac 阻遏物的空间结构,两个binding domian:,四聚体聚合区,C,N,一个四聚体聚合区,阻遏物与DNA的结合,i）电镜观察,Lac repressor,ii）X-ray分析,两个单体结合在一个完整的lacO区；,四聚体可以结合两个lacO。,iii）DNA测序分析,阻遏物所结合的DNA有26bp（-5 +21）。位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。,GTGGAATT
13、GTGAGCGGATAACAATTT,ATG,mRNA,protein,RNA pol binding site,repressor binding site,对称轴,乳糖操纵子的正调控（positive control）,Jacob-Monod 模型没能回答一个关键性的问题：,为什么E.coli 在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（lactose）的培养基（medium）中不启动lac 操纵子的转录？,Answers to this question emerged from molecular studies carried out long after publication
14、of the operon theory.,（1）正调控因子（positive regulator）,在有些启动子上，RNA pol结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开DNA双链。,CAP是lac operon的正调节因子。,（2）CAP的作用原理, cAMP+CAP cAMP-CAP复合体, cAMP-CAP与lac操纵子启动基因上的一个位置结合后 ，RNA聚合酶才能与启动子结合。, cAMP是由ATP经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。,ATP,cAMP,Adenyl cyclase,葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，从而 间接地抑制了La
15、c操纵子的转录。,CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖 操纵子中也起作用。,葡萄糖浓度 cAMP葡萄糖浓度 cAMP,（3）CAP与DNA的结合,lac操纵子中，CAP结合位点位于RNA pol结合位点的上游（-22bp）。,结合部位位置,不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。,operator,CAP,promotor,结构基因,半乳糖,乳糖,阿拉伯糖,结构基因,operator,promotor,CAP,operator,CAP,promotor,结构基因,以二聚体形式与DNA结合。使DNA弯曲90度。,结合形式,TGTGAGTTAGCTCAC ACACTCAATCGAGTG,结合处DNA的保守序列回文顺序,每一部分结合一个CAP。,调节基因的产物作为阻遏物与操纵基因结合，从而关闭操纵子，称为负控制。 调节基因的产物（例如CAP蛋白）作为激活因子开启转录，增加酶或蛋白质的合成。称为正控制。,真正的诱导物是别乳糖。别乳糖的产生需要半乳糖苷酶。 问题：第一个别乳糖是如何产生的？ 答案:存在本底组成型合成。,本底组成型合成 阻遏蛋白与lacO的结合有一个1020分钟的半衰期： RNA聚合酶抓住阻遏蛋白脱离lacO的极短时间，转录产生1-2个mRNA, 翻译生成三种酶.,小结,有葡萄糖存在时，,
