1、第三部分 氨基酸和蛋白质,一、蛋白质的基本结构单位氨基酸,蛋白质和多肽的肽键可被催化水解 酸/碱能将蛋白完全水解，得到各种AA的混合物 酶水解一般是部分水解，得到多肽片段和AA的混合物 地球上天然形成的AA300种以上。构成蛋白质的AA只有20余种，且都是-氨基酸。,蛋白质shi胨多肽肽AA1*104 5*103 2*103 1000 200500 100, 结构通式： ( 脯氨酸除外),aa,（一）常见氨基酸（20种）的结构及分类,(兼性离子形式),（中性分子形式）, 分类,一氨基一羧基 aa ：Gly, Ala, Val, Leu, Ile,含羟基 aa ：Ser, Thr,含硫 aa ：
2、Cys, Met,含酰胺基 aa ： Asn, Gln,一氨基二羧基 aa (酸性 aa )： Asp, Glu,二氨基一羧基 aa(碱性 aa )：Lys, Arg,Phe Tyr Trp,His Pro,-,根据R基化学结构和极性分类,黑色：非极性R基氨基酸 绿色：极性R基氨基酸, 一氨基一羧基氨基酸,脂肪族氨基酸,（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）,返回,羟基氨基酸：,（丝氨酸、苏氨酸）,返回,含硫氨基酸：,（半胱氨酸、甲硫氨酸）,返回,返回,返回, 二氨基一羧基氨基酸：,（赖氨酸、精氨酸）,返回,芳香族氨基酸,（ 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）,返回,杂环族氨基酸,（组氨酸、脯氨
3、酸）,因为其特殊的环状R基团，脯氨酸（Proline）一般不出现在-螺旋中，而经常出现在-螺旋的开始处。,由常见AA经修饰而来的不常见的蛋白质AA,羟脯氨酸 ：亚氨基酸之一，一般蛋白不存在这种氨基酸。在动物胶和骨胶原中含有L-羟脯氨酸。在生物体内羟脯氨酸是由脯氨酸合成的，但不是以游离状态，而是在肽链中被羟基化。,5-羟赖氨酸：与羟辅氨酸同在胶原中发现，是一种特异的氨基酸，在5位上带有羟基。一般认为其合成是和羟辅氨酸一样，是赖氨酸在胶原前驱物质肽中被氧化而产生的，但与羟辅氨酸比较，其含量很少。,150多种 多是蛋白质中L型-AA衍生物 有一些是-，-，-AA 有些是D-型AA,其他的非蛋白质AA
4、,鸟氨酸瓜氨酸,鸟氨酸 ：是一种碱性氨基酸，在蛋白质中不能找到。作为尿素循环的一部分与尿素生成相关，在生物体内与精氨酸、谷氨酸、脯氨酸能相互转变。在鸟类中它与2分子的苯甲酸或苯乙酸等结合成鸟尿酸的形式起解毒作用。,（二）氨基酸的物理性质,都为白色晶体，不同氨基酸结晶形状不同。 熔点很高，一般在200以上。 溶解度：大多数氨基酸都溶于水。Pro溶解度最大，其次为lys, Arg。胱氨酸和Tyr的溶解度较小。 氨基酸由于具有不对称碳原子，所以具有旋光性。,20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。,氨基酸的光吸收特性,Tyr max = 275nm Phe max
5、= 257nm Trp max = 280nm,- 蛋白质max = 280nm,在近紫外区(220-300nm）酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸有光吸收。, 氨基酸在晶体和水中主要以兼性离子存在。,（三）氨基酸的酸碱性质,氨基酸的两性解离,氨基酸是一类两性电解质，它既起酸（质子供体）的作用，又起碱（质子受体）的作用。,中性氨基酸的解离（以Gly为例）,注：K1 和K2 分别为-COOH 和 -+NH3的解离常数, Handerson-Hasselbalch公式,利用此公式可判断任一pH条件下氨基酸各种基团的带电状态。,His 在pH7处有显著的缓冲能力,酸性氨基酸的解离 （Glu为例）,碱性氨基酸
6、的解离 （His为例）,中性氨基酸的解离 （Gly为例）,pH=pI,pH pI,pH pI,电场中,静电荷,+,0,-,不移动,移向正极,移向负极,氨基酸的等电点（isoelectric point, pI）, 在一定pH范围内，pH离pI 越远，氨基酸所带静电荷越大；,利用各种aa的pI不同，可通过电泳法、离子交换层析法进行分离。,调节溶液pH值，使氨基酸处于兼性离子状态，此时氨基酸所带正负电荷数相等，即净电荷为0，在电场中既不向阳极又不向阴极移动，这时溶液的pH值即为氨基酸的等电点。,定义,pI为兼性离子两侧相应解离基团pK 的算数平均值。,各种氨基酸的等电点甘氨酸 5.97 丙氨酸 6
7、.02 谷氨酰胺 5.65 缬氨酸 5.97 亮氨酸 5.98 精氨酸 10.76 异亮氨酸 6.02 丝氨酸 5.68 赖氨酸 9.74 苏氨酸 6.53 天冬氨酸 2.98 组氨酸 7.59 天冬酰胺 5.41 谷氨酸 3.22 半胱氨酸 5.02 甲硫氨酸 5.75 苯丙氨酸 5.48 酪氨酸 5.66 色氨酸 5.89 脯氨酸 6.30,与2，4-二硝基氟苯（DNFB 或 FDNB） 的反应,弱碱中,DNP-氨基酸（黄色）,Sanger 试剂,此反应是Sanger法鉴定多肽或蛋白质N末端氨基酸的依据。,(四) 氨基酸的化学反应,1. -NH2参加的反应,与苯异硫氰酸酯（PITC）反应,
8、此反应是Edman法鉴定多肽或蛋白质N末端氨基酸的依据，在aa 序列分析方面占有重要地位。,2. -羧基参加的反应,例：成盐和成酯反应,aa羧基成盐成酯后，-COOH被保护，而-NH2的反应活性加强。,3. -氨基、-羧基共同参加的反应,紫色物质,注意： 脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质。,水合茚三酮,此反应用于定性、定量鉴定氨基酸。,茚三酮反应,成肽反应,肽键,4. 侧链R基参加的反应,氨基酸R基上的功能团也能发生化学反应。,功能团： 羟基（Ser, Thr） 巯基(Cys) 苯基 （Tyr, Trp） 酚基(Tyr) 吲哚基（Trp） 咪唑基(His) 胍基 （Arg） 甲硫基(M
9、et) 非-NH2(Lys) 非-COOH(Asp, Glu),巯基易被空气或其它氧化剂氧化,胱氨酸,注意：二硫键可被氧化剂和还原剂打开,磺基丙氨酸,巯基乙醇 二硫苏糖醇（DTT）,二、蛋白质的一级结构,氨基末端 （N末端）,羧基末端 （C末端）,一级结构定义：,蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序和连接方式。,氨基酸残基,1. 肽的结构通式,例：胰岛素的一级结构,英 Sanger 等，1953,Frederick Sanger,2. 肽键,C-N键具有部分双键性质,肽键一般为反式构型,肽平面,3. 肽的物理和化学性质,物理性质,酸碱性质,化学反应,茚三酮反应、双缩脲反应,主要取决于游离末端的-NH2
10、和-COOH及R基上可解离基团。,短肽为晶体，熔点很高。 在水溶液中以兼性离子形式存在。 具旋光性。,胰蛋白酶： R1= Lys, Arg R2Pro,麋蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）： R1= Phe, Trp, Tyr R2Pro,胃蛋白酶：R1, R2 =Phe, Trp, Tyr , Leu等 R1Pro,嗜热菌蛋白酶：R2=Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Tyr, Met R2Pro,Gly,肽链内切酶,4. 肽链的断裂酶解法和化学裂解法,酶解法,肽链外切酶,CNBr：,羟胺(NH2OH)： 断裂Asn-Gly之间的肽键,化学裂解法,R1= Met, 生成肽酰高丝氨酸內酯,
11、部分裂解Asn-Leu 和Asn-Ala之间的肽键,三、蛋白质的高级结构,维持蛋白质高级结构的作用力,主要是较弱的相互作用，即非共价键或次级键。,包括：氢键、 范德华力、疏水相互作用、 盐键（离子键）,二硫键在维持蛋白质构象中也发挥重要作用。,可在多肽主链的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水之间等处形成。,氢键（hydrogen bond）, 包括三种较弱的作用力: 定向效应：极性分子(或基团)之间 诱导效应：极性和非极性分子(或基团)之间 分散效应：非极性分子(或基团)之间, 范德华距离（接触距离，contact distance）,范德华引力只有在两个非键合原子处于一定距离才能达
12、到最大，这个距离称为范德华距离。等于两个原子的范德华半径之和。,范德华力很弱，但具有加合性。,范德华力（van der Waals force）,疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近，这种现象称为疏水相互作用。,定义:,变性剂（尿素、非极性溶剂、去污剂等）可破坏疏水相互作用。,疏水相互作用（hydrophobic interaction）,F = (Q1Q2)/(R2) Q1，Q2: 电荷电量 ：介质的介电常数 R: 电荷质点间的距离,定义: 正、负电荷之间的一种静电作用。,生理pH条件下，酸性aa带负电荷，碱性aa带正电荷。在分子的疏水内部，带相反电荷的侧链可形成盐键。,盐键: 又称
13、离子键（ionic interactions）,对蛋白质的三级结构起稳定作用。,二硫键(disulfide bridge),(二)蛋白质的二级结构(seconary structure),-螺旋（ -helix ） -折叠（ -pleated sheet） -转角（ -turn） -凸起 ( -bulge ) 无规卷曲（random coil）,定义：指多肽链借助H键折叠盘绕成沿一维方向具有周期性结构的构象。,常见类型：,-螺旋（- helix）,-螺旋的结构要点：,1）多肽主链沿中心轴盘绕成右手或左手螺旋； 2）每圈螺旋含3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm，每个氨基酸残基绕轴旋转100，沿
14、轴上升0.15nm；螺旋直径0.5nm; 3） -螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧； 4）相邻螺旋间形成氢键，氢键几乎与螺旋的长轴平行，是由肽键上酰胺氢与其前面N端第四个残基上羰基氧之间形成。,3.613-螺旋,影响-螺旋形成的因素,R基的电荷性质：同种电荷可产生静电斥力。例：多聚Lys(pH7)。,R基的结构： 例：Pro、Hyp可中断-螺旋。,R基的大小：R基大，空间位阻大。例:多聚Ile, -折叠片（ -pleated sheet）, -折叠股,1）肽链主链取锯齿状折叠构象。 2）两条或多条多肽链之间侧向聚集在一起，相邻多肽链羰基氧和酰胺氢之间形成氢键，氢键与肽链的长轴几乎成直角。 3）侧
15、链R基交替分布于片层平面两侧。 4）肽链的走向可以是平行的，也可以是反平行的。, -折叠结构要点：,平行,反平行,-转角（ - turn）,The Structures of two kinds of - turns.,含有4个氨基酸残基。 第一个残基的羰基氧和第四个残基的酰胺氢之间形成氢键。 Gly 和Pro 常在- turn中出现。,-转角结构要点：,-转角可改变肽链走向。, -凸起（ -bugle）,大多数作为反平行折叠中的一种不规则情况。可认为是折叠股中额外插入一个残基。,无规卷曲（random coil）,多具有明确、稳定的结构。 常构成酶的活性部位和蛋白质的特异功能部位。,钙结合蛋
16、白中的 E-F hand 结构,（二） 超二级结构,蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（如-螺旋、-折叠、 - 转角）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，以充当三级结构的构件，称为超二级结构。,三种基本组合形式：、 、 。,定义,2-4股右手 -螺旋相互缠绕形成左手超螺旋,（三）结构域（structure domain）,定义：对于较大的蛋白质分子（或亚基），多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种独立的折叠单位称为结构域。,一般含100-200个氨基酸残基。,例：肌红蛋白（153aa）,例：己糖激酶（约1000aa）2个结构域,结构
17、域存在的优越性：,结构角度：一条长的多肽链先分别折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构，在动力学上更为合理。,功能角度：-通过结构域有利于构建具有特定三维结构的活性中心；-结构域间易发生相对运动，有利于活性中心结合底物施加应力。,The conformational change induced in hexokinase by the binding of a substrate (D-glucose, shown in red).,己糖激酶两个结构域之间为一个裂缝,（四）蛋白质的三级结构,定义：指多肽链在二级结构的基础上借助各种次级键进一步盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。,含有多
18、种二级结构元件，具有明显的折叠层次。 紧密的球状实体，但活性部位具松散区域，以利于构象变化。 疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。 分子表面有一个空穴（裂缝、口袋、凹槽），是结合配体并行使生物学功能的部位。,共同特征：,一级结构：Mr.16700，含153aa, 由一条多肽链和一个血红素辅基组成。,二级结构： -螺旋： 8段，命名为A, B, CH松散肽段：位于螺旋之间和C末端,三级结构：8个螺旋段大体分成两层，整个分子紧密结实，分子内部仅能容纳4个水分子。,Mb是哺乳动物肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。,例：肌红蛋白(Mb)的三级结构,血红素（heme）结合的位置,位于肌红蛋白表面的
19、疏水洞穴内。疏水微环境可防止Fe（II）被氧化成Fe（III）从而失去载氧能力 。,血红素（Fe-原卟啉IX）,卟啉,血红素（铁原卟啉IX ）由原卟啉IX与一个Fe原子（II或III）组成。,Fe（II）有六个配位键，四个与卟啉N结合，第5个与F8His残基的咪唑N结合，第6个呈开放状态，是O2的结合部位，其附近为E7His。,因E7His的存在而产生的空间位阻可降低血红素对CO的亲和力。,（五）蛋白质的四级结构,定义,具三级结构的球状蛋白质以非共价键缔合在一起，形成的聚集体称为蛋白质的四级结构。其中每个球状蛋白质称为亚基。,指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质生物活性的现象。,
20、寡聚蛋白质与别构效应,例： 血红蛋白的结构和功能,（1） 寡聚蛋白质: Mr. 65000。具四个亚基（22 ），每个亚基与一个血红素分子结合。（2）一级结构: : 141aa :146aa9个保守残基：F8 His (87, 92)、E7His（58, 63 ）等（3） 二、三级结构： 和链与Mb 相类似,（4） 四级结构：,分子近球形，四个亚基占据四面体的四个角，以盐键相连。,由于这些盐桥，血红蛋白在未与氧结合之前，分子构象受到很大束缚。,The three-dimensional (quaternaryl structure of deoxyhemoglobin. (a) A ribbo
21、n representation. (b) A space-filling model. The subunits are shown in white and light blue; the subunits are shown in pink and purple. Note that the heme groups, shown in red, are relatively far apart.,Salt bridges between subunits in hemoglobin.,四、蛋白质的理化性质及分离纯化技术,1. 蛋白质的大小和分子量,蛋白质分子量: 6000 1106 道尔
22、顿，甚至更大。,对于简单蛋白质： 氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量 / 110,蛋白质的分子量也可用沉降系数表示。,沉降系数（S）：单位离心场下的沉降速度。1S = 10-13秒,蛋白质、核酸、核糖体 的沉降系数介于1200S之间。,2. 蛋白质的酸碱性质,蛋白质是两性电解质。 可解离集团主要来自侧链上的功能团。 蛋白质的等电点,蛋白质在等电点时溶解度最低。 利用蛋白质的带电性质，可采用电泳法和离子交换层析分离蛋白质混合物。,胃蛋白酶,卵清蛋白,血清清蛋白,乳球蛋白,胰凝乳蛋白酶原,溶菌酶,脲酶,3. 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀,(1) 蛋白质是亲水胶体。水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水
23、胶体。,(2) 蛋白质的沉淀（precipitation）：,破坏水化层与双电层的因素可破坏蛋白质胶体的稳定性而使其沉淀。,沉淀蛋白质的方法及应用,4. 蛋白质的变性,2. 变性因素物理因素：热、紫外线照射、高压等化学因素：有机溶剂、脲 、胍、酸、碱,定义：天然蛋白质分子在某些物理化学因素的影响下，次级键被破坏，天然构象解体，致使物化性质和生物学性质发生改变，这种现象叫蛋白质的变性。,5. 蛋白质的分离提纯,细分级 （fine fractionation）,前处理 (pretreatment）,粗分级 （rough fractionation）,凝胶过滤(分子排阻层析),层析洗脱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠网状结构，而最先流出柱外；比凝胶网孔小的分子可进入凝胶珠网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外。这样可使大小不同的分子得以分离。,电泳技术,利用分子所带净电荷不同而加以分离的技术，称电泳技术。,在一定pH条件下，蛋白质分子可解离而带电。不同带电颗粒在电场中的泳动速度与带电量、颗粒大小和形状有关。,
