1、第二章 蛋白质化学 Protein Chemistry 第一节 蛋白质概述 一、蛋白质的概念蛋白质是一切生物体中普遍存在的四类生物大分子之一，是生物功能的主要载体。生物遗传形状（存在于信息大分子 DNA 中）是通过蛋白质来表现的。蛋白质是由天然氨基酸(amino acid)通过肽键(peptide bond)连接而成的生物大分子，分子量一般在一万到一百万，甚至高达数百万。 蛋白质种类繁多、各具一定的相对分子量、复杂的分子结构和特定的生物功能。成千上万种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性归根结底是由 20 种常见氨基酸的内在性质造成的。这些性质包括：聚合能力；特有的酸碱性质；侧链的结构及其化学
2、功能的多样性；手性。本节主要讲述这些性质，它们是讨论蛋白质和酶的结构、功能以及许多其他有关问题的基础。二、蛋白质的化学组成1、元素组成C、 H、O、N 、P、S蛋白质元素组成的一个特征是无论样品来源如何，其含 N 量一般均在 15-17%，平均 16%，即 1克的 N相当于 6.25克的蛋白质。粗蛋白% = N% 6.25这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。这里要注意两点：（1）所测蛋白为粗蛋白（2）对于某些蛋白质已知含氮量则不用 6.25。如小麦为 5.83,大豆为 5.71 等。 2、蛋白质的分子组成蛋白质= 多肽链 +非蛋白质物质 (辅基)polypeptide nonprotein
3、 （cofactor）蛋白质在酸、碱、酶的作用下由大分子逐渐水解为分子量较小的胨、肽，最终水解成氨基酸。可见氨基酸是一切蛋白质分子组成的基本单位。有些结合蛋白质含有其它一些小分子物质。三、蛋白质的分类（至少四类）(1)根据蛋白质的分子形状分类球状蛋白质（Globular protein）：易溶解、能成结晶。 纤维状蛋白质（ Fibrous protein- ）：分子形状不对称，类似棒状或纤维状。难溶，结构物质。(2)根据蛋白质的化学组成分类简单蛋白质（Simple protein） -只含有氨基酸。如溶菌酶复合蛋白质（Conjugated protein ）-由简单的蛋白质和非蛋白质物质结合而
4、成。如血红蛋白(血红素)复合蛋白质又可分为色蛋白（血红蛋白） 、糖蛋白、磷蛋白（ AA-OH 结合，卵黄蛋白） 、核蛋白（核糖体-RNA） 、脂蛋白（血浆脂蛋白）(3)根据蛋白质的溶解度分类清蛋白 Albumin 溶于水（血清白蛋白） 。球蛋白 Globulin 微溶于水，而溶于稀盐溶液（大豆球蛋白） 。谷蛋白 Glutelin 不溶于水、醇及盐溶液，而溶于稀酸或碱（米蛋白） 。 醇溶蛋白 Gliadin 不溶于水，但溶于 70-80%的乙醇（玉米醇溶蛋白） 。精蛋白 Protamine 溶于水及酸性溶液，呈碱性。组蛋白 Histone 溶于水及稀酸性溶液，含较多的精氨酸和赖氨酸。 硬蛋白 S
5、cleroprotein 不溶于水、盐、稀碱、稀酸溶液。(4)根据蛋白质的功能分类活性蛋白质（Active protein） 如酶(Enzyme ）and 、激素（Hormone） 、抗体（antibody)等。非活性蛋白质（Passive protein） 是一类结构蛋白质，多起保护和支撑作用。如胶原蛋白和角蛋白(Collagen and keratin) 。 四、蛋白质的分布和生物学意义形态学功能（Morphological function）毛发、皮肤- 角蛋白，骨骼、牙齿-钙+胶原蛋白 生理学功能（Physiology function）：催化、调节、运输、生物膜等营养学功能（Nutr
6、itional function）：外源蛋白的营养功能第二节 蛋白质的基本结构-氨基酸一、蛋白质的水解蛋白质可以被酸、碱和蛋白酶水解，在水解过程中逐渐降解成分子量越来越小的肽段，直到最后成为氨基酸的混合物。蛋白质多肽 寡肽二肽氨基酸根据蛋白质的水解程度可分为完全水解、部分水解三种蛋白质水解方法的优缺点1、酸水解6mol/L 盐酸或 4mol/L 硫酸水解，20 小时左右，完全水解。优点不引起消旋作用，得到的是 L-氨基酸。缺点色氨酸完全被沸酸破坏 ，羟基氨基酸和酰胺被部分水解。2、碱水解5mol/LNaOH 共煮 10-20 小时，即可完全水解。在水解过程中，多数氨基酸有不同程度的破坏，产生消
7、旋作用。特别是引起精氨酸脱氨。3、酶水解不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。但一种酶往往水解不彻底南需要几种酶的协同作用才能使蛋白质完全水解，并且酶水解所需时间较长。常用的蛋白酶有动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶二、氨基酸（Amino acid）的结构与分类1、氨基酸的结构通式（1）都是 -AA，有酸性的-COOH 基和碱性的 NH2，为两性电解质。（2）如果 RH，-C 为不对称 C 原子，因而是光学活性物质。第一特点使不同氨基酸具有某些共同的化学性质；第二特点使各种氨基酸具有某些共同的物理性质。除 Gly 无不对称 C 原子因而无 D-及 L-型之分外，一切 -氨基酸的 -C 原子都为不对
8、称 C 原子，都具有光学活性，能使偏振光平面向左或向右旋转，向右旋转的叫右旋体，以（+）表示，向左旋转的叫左旋体，以（-）表示。氨基酸的 D-及 L-型（即氨基酸的光学异构体的表示方法及命名）是以甘油醛或乳酸为原始参考标准的。由于在天然蛋白质中发现的氨基酸都属 L 型，因此 L 型氨基酸称为天然氨基酸。 （目前还不能肯定高等动植物是否含有 D-型氨基酸，但在细菌中也有发现，且是与氨基糖结合，其生物学功能尚难确定） 命名：氨基酸的化学名称根据有机化学标准命名法命名，如：，-二氨基己酸（赖氨酸）通常多用俗名，即根据天然氨基酸的来源和性质命名。如 -氨基乙酸由于具有甜味而称甘氨酸等。2、常见氨基酸的
9、分类及结构氨基酸通常根据 R 基团的结构和性质，有三种主要分类方法(1) 、根据 R 基团的化学性质分为：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环族氨基酸 (2) 、根据 R 基团的酸碱性分为：酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸 (3) 、根据 R 基团的电性质分为R 基团带电荷 AA（酸、碱） 、R 基团不带电荷极性氨基酸（羟基、酰胺、巯基） 、非极性氨基酸（烃链、芳香环、硫甲基） 3、蛋白质分子中的非标准氨基酸稀有氨基酸非蛋白氨基酸自然界中还有 150 多种不参与构成蛋白质的氨基酸。另外还有从营养学角度分的根据氨基酸对人体生理的重要性和体内能否合成，将氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸两大类。必需
10、氨基酸（essential amino acids） ：对成人有八种必需氨基酸：苏氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和蛋氨酸。而精氨酸，组氨酸是幼儿所必需的，故称为半必需氨基酸。三、氨基酸的理化性质（一）物理性质1.晶形和熔点：-氨基酸均为无色晶体，不同氨基酸晶形不同，氨基酸熔点较高2.全部能溶酸碱性溶液中，少数能溶于有机溶剂，溶水能力与基团的极性有关（二）氨基酸的旋光性（ rotation）从 -氨基酸的结构通式可以看出，除 R 基为氢原子外，即除甘氨酸外，均含有不对称碳原子，其上四个取代基在空间的排列可以有两种不同的方式，即 L 型和 D 型，它们彼此是一种不能叠合的
11、物体与镜象关系或左右手关系，分子的这两种形式称为光学异构体（optical isomers） 、对映体(enantiomers)或立体异构体（stereoisomers） 。一个旋光化合物的旋光性可以用旋光率 Dt（或称比旋光度）来表示，它是 -氨某酸的物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的一种根据。 Dt Dt100/(LC) Dt为旋光率L 为旋光管的长度，单位为分米；C 为溶液浓度，即 100ml 溶液中所含溶质的克数 Dt是在钠灯（D 线， 589.6 或 589.0nm）为光源，温度为 t，管长为 L，浓度为 C 时所测得的旋光度。注意旋光率（比旋光度）不等于旋光度。 如何用它鉴别和测定
12、AA 含量？氨基酸的旋光符号和大小取决于它的 R 基性质，并且与测定的溶液 pH 有关。 当溶剂、温度、一定， Dt值是定值。pH 对 L-亮氨酸（）和 L-组氨酸（ II）的 25 D值的影响通过影响基团的解离而影响旋光度（三）吸光性所有的氨基酸在可见光范围内均无吸收，只有下列氨基酸在近紫外有吸收。Tyr : max=275nmTrp : max=280nmPhe : max=259nm2、氨基酸的两性解离及等电点氨基酸晶体具有很高的熔点，一般在 200以上。例如甘氨酸在 233熔解并分解，酪氨酸的熔点更高（340 ） ，但是普通的有机化合物如二苯胺熔点为 53。此外，还发现氨基酸能使水的介
13、电常数增高，而一般的有机化合物如乙醇、丙酮等却使水的介电常数降低。推测：氨基酸在晶体或水中主要是以兼性离子(zwittterion)亦称偶极离子(dipolarion)的形式存在，不带电荷的中性分子为数极少。氨基酸的滴定曲线(1)反映在不同的 pH 条件下，AA 的带电状态、两性解离及等电点。(2) 计算出氨基和羧基的解离常数pH=pK + lg质子受体/质子供体氨基酸的等电点 Isoelectric point of Amino Acids氨基酸（AA）溶液在某一 pH 时，AA 的氨基和羧基的解离度完全相同，此时，AA 分子所带的正、负电荷相等，即 AA分子的净电荷为零，它在电场中既不向阳
14、极移动，也不向阴极移动，此时， AA 溶液所处的 pH 就称为该 AA 的等电点(Isoelectric point，用 pI 表示)。 AA 在溶液中的带电状态与溶液 pH 的关系当 pH=pI 时，净电荷为 0；当 pHpI 时，AA 带负电。当溶液 pH 偏离 pI 越远，AA 所带的净电荷数目越多。等电点的计算：取决于氨基酸的解离常数对于一氨基一羧基的 AA: pI=(pK1 + pK2)/2对于一氨基二羧基的 AA: pI=(pK1 + pKR)/2 对于二氨基一羧基的 AA: pI=( pKR+ pK2)/23、氨基酸的重要化学反应（1）氨基的反应A、与亚硝酸的反应注：1、此反应氮
15、来自 AA 和亚硝酸，各占 50%， 反应是定量的。2、 -氨基的反应比其它氨基要快得多（3-4 分，可控制时间来控制其它氨基的干扰） ，且亚氨基及杂环中的结合氮（如 Arg，His，Try）无此反应。3、可用于氨基酸定量及蛋白质水解程度的测定。、Pro 是一个亚氨基酸，没有此反应B、与甲醛反应（甲醛滴定法） AA 是一个两性电解质，但不能用酸、碱直接来滴定，因为等当点的 pH 或过高（1213）或过低（12 ）没有适当的指示剂可以被选用。甲醛与NH 2结合后降低了氨基的碱性，是滴定终点移到了 9 附近。注意：1、甲醛的加入使氨基的酸性大大增强，氨基的 PKa 下降到 6.5（原为 9.7）溶
16、液的 PH 降到 6.7，此时可用酚酞作指示剂，以 NaOH 进行滴定，每释放一个氢相当于一个氨基酸。2、此反应可用来测定蛋白质的水解程度C、与酰化试剂反应：该反应在多肽、蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂如：与丹磺酰氯、苄氧（苯甲氧）甲酰氯反应D、烃基化反应：该反应用于鉴定多肽和蛋白质的氨基末端。如：2，4二硝基氟苯（DNFB）. -羧基的反应HOOC-CH2-CH2-CHCOOHHOOC-CH 2-CH2-CH2+CO2 脱羧NH 2 NH 2 成盐.氨基和羧基共同参与的反应A、成肽反应B、与茚三酮的反应 注意：与 Pro反应产物是黄色4、氨基酸的分离制备和分析鉴定目前分离分析常用方法
17、层析法层析技术三个条件：.水不溶性惰性支持物（载体）.流动相（溶剂系统）.固定相（附着在支持物上的水、离子、活性基团）根据作用原理不同，具体技术有：吸附层析离子交换层析 分配层析（纸层析）分子过滤层析等 一、肽的概念1、结构：肽是氨基酸链氨基酸通过肽键连接形成的链状化合物称为肽(peptide） 肽是氨基酸的线性聚合物，因此常称为肽链(peptide chain） 。2、肽与氨基酸的区别相同点：均含有 -COOH，-NH2；不同点：（1）肽中 -COOH，-NH2 的距离比氨基酸大，可离子化程度较低。一般肽链越大，可离子化程度越低。 （2）肽中 N 端的 -NH2 的 PK 比游离氨基酸小，而
18、 C 端的 -COOH 的 PK 比游离氨基酸大，R 基的 PK 在两者之间。二、生物活性肽生物体内一些具有特殊功能的肽，称为生物活性肽（天然肽）一般多为寡肽和分子较小的多肽生物活性肽一般与机体的免疫防御、代谢调节等功能有关。如：谷胱甘肽（GSH） 、神经肽、抗菌肽1、谷胱甘肽-参与氧化还原反应 谷胱甘肽（GSH）是活细胞的重要组成成分，活性的 SH 极易被氧化（变成 GSSG） ，在生物氧化，-SH 保护，酶活性和氨基酸运输中具有重要作用。2、其它肽 第三节 蛋白质的结构一、蛋白质分子的基本化学结构（共价结构）- 一级结构根据国际纯化学与应用化学联合会(IUPAC)1969 年的规定，一级结
19、构专指氨基酸序列，而蛋白质的化学结构则包括肽链数目、端基组成、氨基酸序列和二硫键的位置，又称共价结构。氨基酸如何连接成肽链及氨基酸在肽链中的连接次序。肽键是主要连接键（-CO-NH-） ，多肽链（多个氨基酸以肽键结合形成的链）是一级结构的主体。1.一 级 结 构（ 线 性 结 构） 蛋白质的一级结构 (primary structure)指它的氨基酸序列 。 二 硫 键：价 键 牢 固， 稳 定 蛋 白 质 结 构SH+SH SS巯基 二硫键维持蛋白质一级结构的作用力是： 肽键、二硫键。 蛋白质一级结构的测定氨基酸序列分析氨基酸序列分析的一般步骤(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目；(2)拆分蛋
20、白质分子的多肽链；(3)断开多肽链内的二硫桥； (4)分析每一多肽链的氨基酸组成；(5)鉴定多肽链的 N 一末端和 C 一末端残基；(6)裂解多肽链成较小的片段；(7)测定各肽段的氨基酸序列；(8)重建完整多肽链的一级结构；(9)确定半胱氨酸残基间形成的 S-S 交联桥的位置 二、蛋白质的空间结构1、构型与构象构型：是由于化合物中某一不对称碳原子四种不同的取代基团的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。构型的转变必须发生化学键的断裂构象：是分子内所有原子和原子团的空间排布所形成的一种立体结构。只要分子中发生 CC 键的转动，就会发生构象的变化。影响蛋白质构象的作用力有哪些？内力（内因）：蛋白质
21、分子内各原子间作用力外力（外因）：与溶剂及其他溶质作用力内因为主，外因通过改变内因起作用按不同种类内力以及产生的构象变化把构象划分为二、三、四级层次。 3、蛋白质的二级结构（Protein Secondary Structure） 蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中多肽链本身（主链或骨架）的折叠方式，它借助于氢键排列成自己特有的 -螺旋和 -折叠等片段，它是一种有规则的重复构象象弹簧的螺圈延一维方向伸展。蛋白质的二级结构限于主链原子的空间排列。多肽链的二级结构主要有以下几种方式(1) -螺旋结构（ Helix ）(2) -折叠结构（ pleated sheet ）(3) -转角（ bend or
22、 turn ）(4) 无规卷曲 (random coil) 由于蛋白质主链的基本构象都是以酰胺平面为基本结构单位，有规则的盘曲而成，因此，在讨论主链构象之前先认识酰胺平面。(1) 酰胺平面与二面角(、)酰胺平面（ amide plane ）或称肽平面 （ peptide plane）：每个肽单位的六个原子（CCO NHC）都被酰胺键固定在同一个平面上，该平面称为酰胺平面（或肽平面） 。二面角( 、)：绕 CC 键旋转的角度称 角；绕 NC 键旋转的角称 角。 蛋白质的 二 级 结 构 蛋白质多肽链本身的盘绕与折叠方式。包括 螺旋、 折叠片、 转角、自由回转四种方式。A. 螺旋（蛋白质最常见的二
23、级结构形式） 螺旋是肽链的盘绕形式有左右手之分-螺旋结构特点 1) 主链绕中心轴按右手螺旋方向盘旋，每 3.6 个氨基酸残基前进一圈，每圈前进距离是 0.54nm，每个氨基酸残基占 0.15nm。2) 每个氨基酸残基的亚氨基与它前面第四个基酸残基的羰基氧原子形成氢键，氢键与螺旋轴近似平行。3)侧链 R 在螺旋的外侧。 -螺旋的稳定性是靠 氢键 来维持的。-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种，但天然的蛋白质大多是右手螺旋。影响 -螺旋形成和稳定的因素：氨基酸的组成和排列顺序（如肽中 Pro 无法形成氢键，不能 -螺旋） ；氨基酸所带电荷性质（如不带电多聚丙氨酸在 PH7 水中能自发形成 -螺旋，但多聚
24、 Lys 在同样条件下由于 R 基带正电荷，相排斥，不能形成 -螺旋） ；R 侧链大小（在 -C 边大 R 基由于空间位阻不能形成 -螺旋） 。B、-折叠结构(-片层结构)-折叠结构是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折叠构象的多肽链，侧向聚集，按肽键的长轴方向平行并列，形成折扇状的结构。-折叠构象靠 相邻肽链主链亚氨基和羰基氧原子之间形成有规则的氢键来维系。C、-转角又称 U 形回折、 -转弯或发夹结构。蛋白质分子的主链在盘曲折叠运行中，往往发生 180 度的急转弯，这种回折部位的构象，即所谓的 -转角。-转角是由 4 个连续的氨基酸残基组成的，第一个氨基酸残基的羰基氧原子与第四个氨基酸残基的亚
25、氨基连接来稳定构象。Gly 、Asp、Asn 和 Trp 常常出现在 -转角中。作用力同样是肽键衍生来的氢键但由于只有这一个氢键，只形成 转角结构。 O （ 氢 键 ）HC（NH CHCO） 2N D、无规卷曲它是多肽主链不规则、多向性地随机盘曲所形成的构象。球蛋白分子中常见的一种主链构象。以上是蛋白质的二级结构的主要构象，它们在不同的蛋白质分子中的分布差别很大。(3) 蛋白质的超二级结构 (super-secondary structure)是指二级结构的基本结构单位(- 螺旋、- 折叠等)相互聚集，形成有规则的二级结构的聚集体。已知的超二级结构有 3 种基本组合形式-螺旋的聚集体 ()-螺
26、旋与 -折叠的聚集体 ()-折叠的聚集体 ( 和 )由二级结构组成的三级结构组件，主要存在于球状蛋白质。(4) 蛋白质的结构域在较大的球状蛋白质的分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域(structural domain)。结构域是指花式或二级结构组合而成的局部折叠区域球状蛋白质的独立折叠单位，通常也是蛋白质的功能单位（功能域）小的单体蛋白质只有一个结构域 结构域三级结构大的单体蛋白质有多个结构域 、蛋白质的三级结构A、球状蛋白质分子的三级结构球状蛋白质分子的二级结构不是活性分子的结构形式，需要在二级结构的基础上再盘曲折叠形成三级结构。蛋白质
27、分子的三级结构是指蛋白质分子在一、二级结构的基础上，借助于各种非共价键在三维空间盘曲、折叠成具有特定走向的紧密、近似球状的构象。球状构象给出最低的表面积和体积比，因而使蛋白质与环境的相互作用降到最小，最稳定。 蛋白质分子的三级结构包括全部主链、侧链在内的所有原子的空间排部，但不包括肽链间的相互关系球状蛋白质分子三级结构的构象特征(1) 三级结构的构象近似球形。(2) 分子中的亲水基团大多相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部。(3) 三级结构构象的稳定性主要靠疏水的相互作用来维系。(4) 三级结构形成后，蛋白质分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的表面往往有一个很深的裂隙，活性
28、部位就在其中。三级结构的典型例子是肌红蛋白维系三级结构稳定的作用力有氢键，离子键，疏水键和范德华力，以疏水键起主要作用。B、纤维蛋白分子的三级结构在纤维蛋白分子中螺旋肽链一般为平行排列，例如角蛋白、丝心蛋白、胶原蛋白的三级结构都是如此。维系蛋白质空间结构的化学键：(1) 氢键 (hydrogen bond)(2) 离子键 (盐键)(Electrostatic interactions)(3) 二硫键(disulfide bond) (4) 配位键 (金属键)(metal bond)(5)疏水相互作用(hydrophobic interaction)(6) 范德华力 (van der waals
29、 force)键能：肽键、二硫键离子键 氢键、疏水键 范德华力 离子键 、氢键、疏水键 、范德华力这四种键能远小于共价键，称次级键 次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力,原因何在? 数量巨大5、球状蛋白质分子的四级结构 有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的、具有独立三级结构的肽链单位缔合而成的，这种蛋白质通常称为寡聚蛋白或多体蛋白（multimeric protein） 。寡聚蛋白分子中的每一个三级结构单位称为一个亚基(或亚单位 subunit、单体 monomer)。所谓蛋白质分子的四级结构是指寡聚蛋白分子中亚基与亚基之间的立体排布及相互作用关系 。亚基的数目和类型也是四级结构
30、研究的内容。四级结构的稳定主要靠亚基之间的疏水相互作用来维系。三、多肽、蛋白质结构与功能的关系（一）多肽的结构与功能生物体中存在多种活性肽，如：生长激素、加压素、催产素等。（二）蛋白质的一级结构决定高级结构 1、核糖核酸酶的可逆变性2、蛋白质前体的激活、分子病 镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息正常型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys -镰刀型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys -谷 A（极性） 缬 A（非极性）由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形
31、，与氧结合功能丧失， 导致病人窒息甚至死亡。（三）蛋白质空间结构与功能的关系1、血红蛋白的变构效应与运输氧的功能调节结构改变功能 变构现象：外因通过改变蛋白质构象引起蛋白质功能变化的现象。血红蛋白 （四）同功能(同源）蛋白质结构的种属差异与保守性同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性1、胰岛素一级结构的种属差异与保守性比较各种哺乳类、鸟类和鱼类等动物的胰岛素(insulin)一级结构，发现组成胰岛素分于的 51 个氨基酸残基中，只有 24个氨基酸残基 始终保持不变，为不同生物所共有。这些始终不变的氨基酸残基，称为守恒氨基酸残基( 守恒残基)其他绝大多数守恒残基是带有疏水侧链的氨基。X-光晶体结
32、构分析结果证明这些非极性的氨基酸对维持胰岛素分子的高级结构起着稳定作用，因而推测不同动物来源的胰岛素，其空间结构可能大致相同。一般认为激素的活性中心以及维持活性中心构象的氨基酸残基不能变，否则激素将失去活性。2、细胞色素 c 的种属差异与保守性细胞色素 c 广泛存在于一切需氧生物细胞的线粒体之中，是一种包含一个血红素的单链蛋白质。它在呼吸链中起着传递电子的作用。脊椎动物的细胞色素 c 的多肽链一般是由 104 个氨基酸残基所组成的。对 50 多种不同生物来源的细胞色素 c 的一级结构作了比较研究，发现 35 个氨基酸在各种生物中是保守的其中都含有 Cys 14、 Cysl7、His 18，Me
33、t 80、Tyr 48和 Trp59 。血红素是细胞色素 c 呈现电子传递功能的活性中心。根据各种研究得知，这几个保守残基是保证细胞色素 c发挥电子传递功能的关键部位。同功能蛋白质在种属之间的氨基酸差异大小，通常与这些种属在进化位置的差距大体上相平行。比较 50 多种生物的细胞色素 c 一级结构的种间差异，发现： 凡与人类亲缘关系越远的生物其氨基酸顺序与人的差异越大，这些种属差异可以为生物进化提供重要的依据。这说明生物进化过程中所发生的种属差异，不仅表现在生物的形态结构上，同时也反映在蛋白质分子的一级结构上这也揭示了某些蛋白质在进化上可能来自同一祖先蛋白质，而在长期进化过程中不断分化出结构与功
34、能相适应的蛋白质。第五节 蛋白质的重要性质一、蛋白质的胶体性质真溶液的溶质分子的颗粒大小1nm；胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在 1-100nm；蛋白质分子的相对分子量在 1-100 万，其颗粒大小(2-20nm)属于胶体粒子的范围。另外，蛋白质分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶与水形成稳定的亲水胶体溶液。1、稳定蛋白质胶体溶液的两个因素 (1) 表面电荷 (在非等电点时)与双电层；(2) 水化膜蛋白质胶体溶液具有一般胶体溶液的性质丁道尔现象、布朗运动、 半透膜不透性、吸附性、胶凝性、粘性。2、蛋白质的膜分离技术（Membrane Separation Technique ） 利用蛋白质的
35、半透膜不透性，将蛋白质中所含的、可以通过半透膜将低分子物质(如盐等小分子) 分离的技术称为膜分离技术(或膜过滤技术)。膜分离技术可分为透析（ dialysis ） 、超滤（ultrafiltration ）二、蛋白质的两性解离与等电点蛋白质中可解离的酸性基团Glu 的 -COOHAsp 的 -COOHTyr 的酚羟基Cys 的-SH碱性基团 Lys 的 -NH2His 的咪唑基Arg 的 -胍基蛋白质分子的总解离可用下式表示NH+3-P-COOH (P +)NH +3-P-COO- (P +-)NH 2-P-COO- (P-)蛋白质的等电点蛋白质溶液在特定的 pH 下，其分子所带的正、负电荷相
36、等，净电荷为零，这一 pH 称为 (用 pI 表示)。蛋白质的等电点不是一个恒定值，它受溶液的离子种类和离子强度的影响。蛋白质在纯水中的带电状态不受其它离子的干扰，完全由 H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为蛋白质的等离子点(isoionic point) 。蛋白质的等离子点是特性常数。蛋白质等电点的大小与其氨基酸组成有关。对于变性的蛋白质，可由其酸性氨基酸与碱性氨基酸的比例来判断。对于天然蛋白质，由于其 R 基团不能完全暴露在外，故不易判断。在等电状态下，蛋白质分子物理性质有所改变，最显著的是溶解度最小。 根据蛋白质两性解离和等电点的性质发展起来的蛋白质纯化方法有蛋白质电泳离子交换
37、法等电点沉淀法三、蛋白质的变性作用（ protein denaturation ） 1、概念天然的蛋白质在受到某些物理或化学因素的作用，有序的空间结构被破坏，致使生物活性丧失，并伴随发生一些理化性质的异常变化，但一级结构并未破坏，这种现象称为蛋白质的变性作用。2、蛋白质变性的可逆性可逆变性是指使蛋白质变性的条件解除后，能恢复其原有性质。不可逆变性是指使蛋白质变性的条件解除后，仍不能恢复其原有性质。蛋白质复性（renaturation）：去除变性因素后，可逆变性的蛋白恢复原来的空间结构，恢复生物活性的现象为复性 3、蛋白质的变性因素及其作用机理物理因素热、UV、超声波、X- 射线、高压、表面张力
38、、搅拌、剧烈振荡、研磨。例如 皮肤粗糙、白内障、杀菌化学因素酸、碱、有机溶剂、重金属盐、脲、胍、表面活性剂、生物碱 。作用机理 重金属与-SH 生成不溶性的硫化物浓乙醇、去污剂 破坏疏水作用力4、变性蛋白质的性质变性蛋白质与天然蛋白质性质的差别主要表现(1)理化性质的变化 如：旋光性改变、粘度增加、光吸收性质增加、失去结晶能力、溶解度下降、易发生凝聚和沉淀。(2) 生化性质的变化 变性后的蛋白质易被酶水解。(3) 生物活性丧失 这是蛋白质变性的重要标志。四、蛋白质的变构作用（protein allosteric effect ) 对于具有四级结构、含有亚基的蛋白质来讲，当一个亚基的构象发生变化
39、，而引起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功能发生改变的作用称为蛋白质的变构作用(或称别构作用） 。如 血红蛋白的变构作用五、蛋白质的沉淀作用（precipitation） 1、概念 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的，若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮凝沉淀的现象，就称为蛋白质的沉淀作用。蛋白质的沉淀可分为不变性沉淀用于分离活性的天然蛋白质产品。如： 酶、抗体等。变性沉淀用于生物制品中除去蛋白质。2、沉淀的方法(1) 等电点沉淀蛋白质分子在其等电点时，容易相互吸引，聚合成沉淀(2) 中性盐沉淀盐析（salting out) 在蛋白质溶液中加入高
40、浓度的中性盐后，它与蛋白质胶体粒子竞争水份，使蛋白质胶体粒子表面的水化层破坏而失去稳定性，同时降低了蛋白质与水的亲和力而使蛋白质沉淀的现象。 盐浓度高时，中和了蛋白质分子表面的电荷、破坏了水化层，使疏水区域暴露，疏水基团发生相互作用而沉淀。盐溶（salting in)在盐浓度很低时，大多数蛋白质的溶解度随着盐浓度的增加而增加，这种现象称为蛋白质的盐溶。低浓度的盐可增加蛋白质表面的电荷数量和与水分子的相互作用。分级盐析不同的蛋白质的带电性质、分子量不同，水膜厚度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。一般来讲，分子量越大的蛋白质分子，越容易盐析，所需盐浓度也越低。因此，对于不同分子大小的蛋白质，可采用不
41、同的盐浓度进分级沉淀。常用的盐是(NH 4)2SO4(3) 有机溶剂沉淀 一些极性的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)能破坏蛋白质胶粒的水化层，使疏水基团暴露使蛋白质沉淀。(4) 重金属盐沉淀蛋白质在碱性溶液中带负电，可与重金属离子如 Zn+2、Cu +2、Hg +2、Pb +2、Fe +3等作用，产生重金属蛋白盐沉淀。(5) 热变性沉淀 (6) 生物碱试剂沉淀生物碱试剂（如单宁酸、钼酸、钨酸、三氯醋酸等）具有酸性，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，故能与带负电的酸根相结合，成为溶解度很小的盐类。六、蛋白质的沉降作用（sedimentation)1、概念蛋白质由于其比重大于水，而水中下沉，这就是蛋白质的沉
42、降作用。蛋白质胶体粒子在静止溶液中，因重力 F=mg 很小，沉降 1cm 需几年的时间。为了便于观察和利用这一现象，通常外加一定的力（如离心力） ，来加速沉降过程。蛋白质的沉降速度与分子大小和密度有关。蛋白质的沉降性能通常用单位离心力场中的沉降速度沉降系数来表示七、蛋白质的水解反应可分为 完全水解，产物是氨基酸。不完全水解，产物可以是胨、小肽、二肽和氨基酸。八、蛋白质的颜色反应（1）一般颜色反应：氨基酸所具有的颜色反应一般情况下蛋白质都有。一些氨基酸地 R 基团具有特殊地颜色反应：米伦反应 红色 酚基黄色反应 黄色 苯基酚试剂反应 蓝色 酚基、吲哚基坂口反应 红色 胍基（2）特殊颜色反应双缩脲
43、反应两个以上肽键（双缩脲）在碱性溶液中与硫酸铜结合。生成紫红色或红色物质。九、蛋白质的紫外吸收性质一般蛋白质在 280nm 波长具有最大吸收，这是由于蛋白质分子中的 Trp、Tyr 和 Phe 存在共轭双键的缘故。第六节 蛋白质相对分子质量的测定蛋白质的相对分子质量一般在 6000 至 100 万常用的测定方法有:1、根据化学组成测定最低相对分子质量2、渗透压法测定相对分子质最3、凝胶过滤法测定相对分子质量4、凝胶电泳法测定相对分子质量5、沉降法测定相对分子质量、凝胶过滤法测定相对分子质量原理：将具网状结构的葡聚糖凝胶装柱，对分子量不同的蛋白质，由于进入多孔性凝胶颗粒的能力不同而在流动相流动过
44、程中所走路径不同，从而有不同的洗脱体积，来达到分离。凝胶法只适于测定球状蛋白分子的相对质量2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶具网状结构，作为电泳介质SDS十二烷基硫酸钠【CH 3(CH2)11OSO3Na】 ，它是一种阴离子表面活性剂，也是一种有效的蛋白变性剂通常在待测分子量的蛋白质样品中加入巯基乙醇和 SDS。巯基乙醇打开蛋白质分子二硫键；SDS 破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，并与之形成 Pr-SDS 复合物SDS-Pr 复合物的特点：复合物带大量负电，使得不同 Pr 电荷密度相同使球状 Pr 变成雪茄状，长轴MW电泳时迁移率仅与蛋白质分子量（MW 或分子的长轴）有关，而与分子形状
45、和带电状态无关。 3、超离心沉降法原理：不同分子量的 Pr 颗粒会以不同的速度沉降下来。用特殊的光学系统可观察到沉降界面，从而得 pr 沉降速度。 蛋白质的沉降常数(沉降系数, Svedberg Unite)不同的蛋白质由于其分子大小不同，在一定的离心力场中沉降的速度也不同。沉降的速度是蛋白质在单位时间内下沉的距离，即 v=dx/dt。沉降常数(s 小写)单位引力场中沉降分子的下沉速度。它表示沉降分子的大小特性。 s=v/2x沉降常数是蛋白质的特征性常数，它反应蛋白质分子的大小。由于已知的蛋白质分子的沉降常数在 110-1320010 -13秒之间，当蛋白质浓度为 0 时，沉降常数为110-13，故将 110 -13 用 1个 Svedberg单位表示(简写为 1S，大写)。蛋白质的相对分子质量：Ms斯维德贝格公式（Svedberg ) M = RTs / D(1-）其中：M：蛋白质的相对分子质量s：为沉降系数，单位秒或“S” 一般 Pr 的“s”在 120010 -13 秒 范围内，为方便将 10-13 秒 作一个单位 漂浮单位“S” D：扩散系数；：蛋白质的偏微比容（0.74cm 3/g） ；：溶剂的密度；R：气体常数；T：绝对温度
