1、Stratagene 定量 PCR 仪标准曲线制作方法 定量 PCR 定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品 和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物 检测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。 标准样品的准备 1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方 法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质 粒，因为质粒是环状 DNA 有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也 有用线状的 PCR 产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片
2、段要大一些，这也是为了获得 分子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确 定，先得到标准品的浓度 C(ng/uL)，因为无论是质粒还是 PCR 产物它们的序列都是已知的， 这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量 B，则标准品的拷 贝数 A(copy/uL) 为： A=C/B6.02E+14 2、相对定量。主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样 品和实验样品中基因表达的比值） ，这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须 知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 实验中的标准品可以是来源比较丰富的细
3、胞或组织的 RNA 转录得到的 cDNA。将这种 cDNA 进行梯度的稀释，可以是稀释 10 倍，100，1000，10000 等倍（具体实验要根据具 体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基 因的扩增） 。而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实 含有的基因数量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释 度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如可以把前面稀释十 倍的样品赋值为 10000 个拷贝，100 倍的赋值为 1000 个拷贝依次类推把 10000 倍的赋为 10 等。要注意，
4、赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是 10 稀释，后 面赋值也是 10 倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准 品还是未知样品都将跑出曲线，获得了 Ct 值。那么先可以把未知样品放到一边，对于标准 品来说，既获得了 Ct 值，还知道他们的拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是我们 自己赋予的） 。这样可以通过标准品的 Ct 值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标， 而 Ct 值为纵坐标） 。一旦作出了标准曲线，而未知样品的 Ct 值知道（通过实验求得的） ， 这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知
5、样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以 及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来了。举例来说如何进行设置 1、先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上 unknow 或 standard 等信息。 2、选择要使用的荧光染料。 3、设置复孔。 如果有些孔有重复就用用样的数字标明，这样仪器就知道哪些是重复，最终结果处理的话 也可以取平均等操作。有相同标号的系统就认为是同样的样品的重复。 4、标准品赋值 接下来要给标准品赋上值，系统要知道按照什么去计算 标准品赋值要先选上要赋值的标准品，然后在工具面
6、板中输入相应的值。 为了方便设置系统有一个自动增加稀释倍数的设置，点开后就可以选择你的稀释倍数，然 后用鼠标去选择孔的时候会自动增加 选择稀释倍数 每次选择不同的孔，在里面赋的值会自动按照倍数增加 填入标准品的量 自动增加稀释倍数5、设置温度 在这里提供一个对于 SYBR 染料常用的温度的控制模板，可以参考。注意最后的溶解曲线 制作过程在升温的过程中选择标有 all 的放大镜，代表从 55到 95逐渐升温的过程中不 停的检测荧光信号。 6、设好了之后可以运行程序了，最后的标准曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未 知样品的拷贝数。Stratagene 荧光定量 PCR 仪基因表达分析解决方案
7、 Stratagene 荧光定量 PCR 仪和配套的 Mxpro 软件在处理基因表达分析方面的功能比较 强大，下面简要说明如何使用该软件来进行基因表达分析。 例如要分析 IL1 基因的表达情况，用看家基因 GAPDH 作为内参，采用的是 SYBR GreenI 染料法。 1、板设置 1.1、专门的基因表达分析实验模式。打开 Mxpro 程序操作窗口，首先弹出的对话框是要用 户选择要进行的实验类型，做基因表达分析可以选择第二项 Comparative Quantitation (Calibrator)。 1.2、方便的类型选择和孔设定。在板设置中选择样品的类型，可以将样品的名称写成 GAPDH
8、和 IL1，并将 GAPDH 设为看家基因（NORM） ，这样设置非常清晰，有利于分析 结果。如果实验中使用了复孔，则在复孔上标上相同的数字，代表这些样品是重复，下图 中每个样品重复三次。基因表达分析实验同一个 cDNA 既要做目的基因，也要做看家基因。看家基因和目的基因 来自同一样本的用相同的字母来标记，如果是对照样品则标上 Calibrator。1.3、方便而快捷的反应条件设定。可以很容易设定扩增反应条件和熔解曲线条件。 2、结果分析 2.1、多种分析结果可供选择 扩增曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因（和板设置中选择的颜色相同） 标准曲线，看家基因和待测基因的标准曲线都能被作出
9、来，并显示出分别的扩增效率。如果不做标准曲线，用户也可以根据经验写入扩增效率的值，这样最后的计算结果也可以 根据用户写入的扩增效率进行计算。 扩增效率的引入方法是点软件操作界面上方的 Term settings 键 ，打开 Analysis term settings 对话框，点里面的 Efficiency Settings，在 efficiency 框中输入不同基因的扩增效率。 熔解曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因，峰位置代表产物的 Tm 值的温度， 图中可以看到看家基因和待测基因的产物基本具有相似的 Tm 值。基因表达差异柱壮图显示，程序可以自动计算出基因表达的差异，并用柱壮图
10、显示出来， 每一个柱表示一个样本，基因表达的趋势清晰可见，对照样本被算为 1。 柱壮图还可以表示成 Log 的形式，这样可以清楚分开上调和下调的样本。 数据文本显示，实验得到的数据可以以文本的形式显示出来，用户可以很直观的看到用于 计算的具体数据，自己也可以利用这些数据进行统计计算。2.2、数据导出 实验产生的结果都可以方便地导出，图片可以导成图片格式、Excel 图片或 Powerpoint 等， 数据也可以导入 Excel 或文本文件中。 多种数据的导出形式。基因表达分析板设置方法 Stratagene 荧光定量 PCR 仪的应用软件 MxPro 提供了比较强大的基因表达差异分析功 能，要
11、很好的运用这些功能的前提是要告诉仪器一些必要板设置信息。下面举例子来说明 如何来进行板设置。 在这里举一个例子，用 SYBRGreenI 染料法，用 GAPDH 作内参，检测不同样品中 LI1 的基因表达差异，在这里要设置各自的标准品样品和阴性对照等信息。 首先打开分析软件，选择基因表达分析一项 基本信息设置：软件首先出现的界面就是板信息设置界面。先选中要放置反应管的位置 A- D 四行，接下来就是在程序界面的右边的设置命令面板上给选中的孔上填入信息。信息的 输入顺序一般是从上到下的。 首先要选择孔的类型（Well type） 。在孔类型中可以选择 Unknow( 未知样品)，Standard
12、 （标 准品） ，NTC（阴性对照）等。为了方便起见，我先将所有的孔都设置成 Unknow 。 设置命令 面板然后再选择使用的荧光染料，这里由于只用到了 SYBR GreenI 一种荧光染料，所以就选上 SYBR。如果实验当中用了几种荧光染料，就可以将这几种荧光染料都选中。 当选中了荧光染料之后，板设置的基本信息已经输入电脑了，实验可以运行了。以下信息 可以在实验进行之前设置，也可以在实验结束之后再设置。 不同基因设置：由于做基因表达分析实验通常要做目的基因和看家基因，所以接下来要告 诉软件目的基因和看家基因的名字，软件才能加以区分。点 Assign assay name 打开如下对 话框由于
13、用 SYBR 染料做两种基因，所以应该在 SYBR 后面的 Assay 栏中写入看家基因和目的 写看家基因和目的基因名基因名称。假设前两排是 GAPDH，后两排是 IL1 ，则可以在 assign assays within selected wells 中选择 SYBR 并输入 GAPDH 和 IL1 的名称，同时你可以选择一个颜色代表不同的基 因。这样系统就可以分辨哪个孔是什么基因了。 用红色代表 IL1 这时候软件只知道在这个实验中检测了两个基因，而哪个基因是看家基因并不知道，下一 步是要告诉系统哪一个是看家基因，在 Normalizing assay 中选择 GAPDH 就可以了 这时
14、候原来图上的 GAPDH 就变成了 NORM 重复设置：接下来设置重复，每一个样品设置了三个重复。如果一个样品重复三次，这些 相同重复的样品可以标上同样的一个数字，这时系统就知道标有同样数字的孔是重复样品， 将来在分析数据的时候可以对这些样品进行取平均等操作。标准品设置：先将标准品和未知样品分开，在本实验中 A 行为看家基因的标准品，C 行为 目的基因的标准品。分别选择 A 行和 C 行，在 Well type 下拉菜单中选择 Standard 将其设 置成标准品类型。 在设置命令面板 Standard quantity 中写入标准品的量。可以利用 Auto-Increment 来自动设置 稀
15、释的倍数。 样品组织分类：看家基因和目的基因未知样品应该对应起来，即同一个 cDNA 样品应该既 作了目的基因也作了看家基因。再接下来把来自同一个 cDNA 的样品的目的基因和看家基 因扩增标出来。可以在 Identify associations 中的 Assoc.symbol 下拉菜单中选择一个字母来 标记用同一个 cDNA 模板分别扩增目的基因和看家基因的孔。上图中的 ABCD 表示标号相同是来自同一份组织，这样就把同一份组织中的看家基因和目 的基因对应了起来。 选择对照样本：在基因表达实验中总要选择一个 cDNA 样本作为基因表达的基准，比如实 验中会有一个正常样本，最后的表达结果作为
16、 1，所有其他的样本的基因表达量都和它相 比较，这个作为基准的样品称为 Calibrator。在板上选中这个 cDNA 样品对应的目的基因和 看家基因，在 well type 中选择 calibrator。 这样板设置就完成了。熔解曲线设置方法 熔解曲线的原理 定量 PCR 的荧光标记方法通常有两种，一种是探针法，一种是染料法。染料法通常指 的是用 SYBR GreenI 染料作为荧光标记。 SYBR GreenI 这种染料之所以可以用来定量，是因为它的特殊性质决定的。第一，它 可以非特异性地结合到双链 DNA 的小沟处，和单链 DNA 以及蛋白都不结合。第二， SYBR GreenI 这种染
17、料游离存在的情况下它没有荧光，一旦它和双链 DNA 结合了，再用 一定波长的光激发它时就可以发出很强的荧光（大概是游离状态的 1000 倍） 。我们再想 PCR 的过程，PCR 的最终产物正是双链 DNA ，随着每次的循环双链 DNA 产物的数量成指 数增长。如果把 SYBR GreenI 这种染料加入到反应体系中，就可以随着每次循环结合到双 链 DNA 产物上。产物的量越多，结合的染料就越多，染料发出的荧光就和产物的量成正 比，因此通过检测 SYBR GreenI 的荧光就可以时实监控 PCR 反应的产物变化。 SYBR GreenI 染色法的优越性是使用方便，不用专门设计探针。想检测不同的
18、基因只用在 PCR 体系中加入同一种荧光物质就可以。而且价格非常便宜，因此在科研领域里还是非常 常用的。但它主要的缺点是灵敏度不够。因为 SYBR GreenI 可以和 DNA 双链非特异性的 结合，那么如果 PCR 反应有非特异性的扩增产物或引物二聚体的话也会结合这种染料，因 此实验的结果往往就会受到一些因素的干扰。 当采用 SYBR GreenI 染料法做定量 PCR 实验时为了确定实验产物中有没有引物二聚体或非 特异性的引发，一般要在反应结束之后做一个熔解曲线。熔解曲线的原理是根据 SYBR GreenI 染料只和双链 DNA 结合的特性，设计一个从 55 到 95逐渐升温的过程，随着温
19、 度的升高，双链 DNA 在不断的解链，SYBR GreenI 染料的结合数量也在减少，发出的荧 光也越来越少，当到达产物 Tm 值的时候，荧光信号突然下降，然后趋于平缓，这时双链 完全解开，不发荧光。 一个典型的熔解曲线如下（纵坐标是荧光信号强度，横坐标是温度）： 通过数学换算，荧光信号变化最快的温度就可以换算出一个峰，这个峰的位置就代表 产物的 Tm 值。如果产物当中有多种组分比如引物二聚体（如下图） ，这样就会出现多个峰，这样就可 以判断出是否有引物二聚体或其他组分，反应条件是否需要优化。Stratagene 软件如何进行熔解曲线设定 Stratagene 软件熔解曲线实验方法设定有两种
20、 1、利用 All point 检测。Stratagene 软件具有两种检测荧光检测方式，一种是 End point 另一种是 All point ，End point 是在整个反应步骤的末尾检测荧光信号，All point 是在整个反应步骤中尽可能多的检测荧光信号。所以就可以利用 All point 在 55到 95升温过程中检测荧光信号。设置方法是将 All point 标志 从设置命令面板上拖到 温度曲线上。 2、利用循环升温设置。这是利用 PCR 仪每个循环温度可以升高一定温度的特性来做的。 先设计出如下的温度曲线形式： 拖到温度曲线 上在 40 个循环的反应结束后，又设计了两个 Se
21、gment，3 和 4。Segment3 是升温到 95，1 个循环。接着设置 Segment4 中的温度，可以双击 55的温度平台打开如下对话框： 在 Cycle increments 中设置循环温度升高幅度。如果设计每个循环升高 0.2，则在 Temperature 中输入 0.2，如果从 55升温，每次增高 0.2则需要进行 201 个循环才能 到达 95，所以循环数应为 201。在 Data collection 中选择 Type 为 End point，#of endpoints 设定为 1（只采集一次荧光信号） ，设定结果如下： 最后得到的温度曲线设置图是：SNP 检测应用 荧光定
22、量做SNP 检测的原理 SNP（single nucleotide polymorphisms）即单核苷酸多态性，是人类基因组中最简单的 一种多态性形式，是指在不同的基因样本中，的某一位点只有一个碱基的不同。虽然 DNA 的组成中有 4 种碱基，但在 SNP 中一般只有两个碱基的互换，所以它是一种二态性的标记。 正因为 SNP 的这些特点，要用荧光定量 PCR 技术检测某一未知样品是否有某一位点 的 SNP ，就只需要设计两条探针分别用不同的荧光标记，这两条探针只在这个 SNP 位点有 一个碱基的不同。最后用定量 PCR 反应检测是哪一种荧光被释放出来了，就可以说明该位 点应该是怎样的 SNP
23、。最后介绍如何用定量 PCR 的办法来检测未知样品的 SNP 位点。 如图，例如我们已知某一位点可能发生 A 到 C 的 SNP 变化，因此我们可以设计两种 探针在该位点分别设成 T，G 。只有一个碱基的差异，分别把这两种探针标记成不同的荧 光。这样在 PCR 反应过程中，探针只有和模板完全匹配荧光才能被释放出来，所以根据检 测到是哪种荧光就可以确定是否有相应的 SNP 位点。 这是检测结果，左边的检测到一种荧光，说明这个样本的该位点只含有一种碱基。而 右边的图中两种荧光都被检出，说明这些样本中两种碱基的 SNP 都有。Mx3000P 中 SNP 分析功能 Mx3000P 定量 PCR 软件中
24、提供了专门的强大的 SNP 分析功能。当用户打开软件后首 先看到的是实验类型的选择包括：普通定量，相对定量，SNP 分析，只读板实验等，根据 用户的需要可以选择不同的实验，就可以进入不同的实验模式开展实验了。如果要进行 SNP 分析可以有两种选择，可以选择第四项 Allele Discrimination/SNPs Real-Time，就进入 专业的定量 SNP 分析程序界面，也可以选择最后一项 Plate Read/Allele Discrimination 进行 专业的 SNP 终点判别。 定量 SNP 分析 是指利用定量 PCR 扩增的方法检测 SNP ，可以选择实验类型对话框中的第四项
25、 Allele Discrimination/SNPs Real-Time 在板设置框中用户可以轻松设置样品类型、名称、所用荧光素等必要信息。由于 SNP 分析 中需要进行类型的判定，所以必须设立可靠的对照，一般实验当中要设立两种荧光的阴性 对照和阳性对照，还要有空白对照才能进行结果判定。结果运行后有强大的分析功能，包括扩增曲线分析、双点图分析、板数据计算、板结果显 示和结果文本显示等功能。非常方便易用用户可轻松掌握。 用户如果只想通过终点判读的方法分析 SNP 也可以选择最后一项 Plate Read/Allele Mx3000P 只读板定量分析 是指在 PCR 反应结束之后，利用定量 PC
26、R 的荧光读取功能，对反应的终点进行检测，再 通过软件来判断 SNP 分型的方法。Mx3000P 软件提供了 Plate Read/Allele Discrimination 功 能，进入只读板模式来分析 SNP，Mx3000P 同样提供强大的分析功能。一般实验当中也要 设立两种荧光的阴性对照和阳性对照，还要有空白对照才能进行结果判定。荧光定量 PCR 在基因表达分析中的常见问题 所谓基因表达就是指在特定的时刻某种感兴趣的基因在组织或细胞中的 mRNA 的表达 数量。众所周知，很多的疾病（如肿瘤）的发生发展，很多药物的作用机理，很多生物的 代谢调控作用等都和基因表达的变化有关，因此对基因表达进
27、行精确定量是十分重要的。 过去为了对 mRNA 进行定量有了各种各样的方法，如 Southern 杂交、Northern 杂交、原 位杂交、传统 PCR 等，但是我们也都知道这些技术灵敏性较差，重复性不好，操作比较烦 琐，已经无法满足现在科研和检测的需要，于是荧光定量 PCR 技术也就应运而生了。荧光 定量 PCR 技术能对核酸进行精确定量，因此大大提高了在基因表达的准确性和灵敏度，广 泛的应用于肿瘤研究、药物筛选、功能基因组研究等各个领域，目前已经成了很多科研文 章发表的重要实验内容。 基因表达分析中常见到的问题 1、采用什么样的荧光标记方法？ 荧光标记方法一般有两种，一种是探针法，另一种是
28、染料法，即使用 SYBR Green 染 料。由于探针合成的成本比较高，探针设计也有一定的难度，所以在基因表达分析中经常 采用 SYBR Green 染料法进行荧光定量检测。检测的原理是 SYBR GreenI 游离状态下不发 荧光，但当反应体系中有双链 DNA 存在的情况下 SYBR GreenI 就可以非特异性的结合到 DNA 双螺旋的小沟处，发出很强荧光。这样随着 PCR 反应的进行，产物也在不断积累， 结合到双链 PCR 产物上的荧光也就越来越多。通过检测荧光信号强度就可以反映出反应体 系中产物的积累变化情况。 这种 SYBR GreenI 染色法的优越性是使用方便，不需要针对不同的基
29、因专门设计探针。 想检测不同的基因只用在 PCR 体系中加入同一种荧光物质就可以。而且价格非常便宜。但 它主要的缺点是灵敏度不够，如果 PCR 反应中产生了引物二聚体也同样会造成荧光信号的 积累，因此在做实验前往往需要对实验条件进行摸索。 2、要检测的基因有哪些？ 基因表达分析的目的就是检测某种我们感兴趣的基因在不同组织或细胞中的表达差异。 荧光定量 PCR 技术可以对核酸物质的含量进行精确的定量，也就成了研究基因表达差异的 一把利器。 在基因表达分析实验中要检测两个基因，一个是目的基因另一个是看家基因。之所以 要引入看家基因最主要是由于不能确定要比较的样品所用的组织起始量相同。就是说比如 提
30、取正常样品的基因时用了 100 个细胞，而提取病变样品时只用了 10 个细胞，这时候的基 因表达差异可能是由于提取时候的样品细胞数不同引起的。为了纠正这种误差，选用认为 在两个样本中表达量不变的看家基因作为内参照，来去除样品细胞数不同而带来的干扰。 例如，要研究某个基因在肿瘤样品和正常样品中的基因表达差异。在实验中发现要研究的 正常样品中的看家基因的表达量是肿瘤样品中的 10 倍，就认为正常样品的细胞数就是肿瘤 样品细胞数的 10 倍，那么在肿瘤样品中目的基因的基因表达量应该乘以 10 倍，才能和正 常样品进行比较。 3、什么是扩增效率？从理论上来说 PCR 的扩增应该按照 2 的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是 100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是 100% ，甚至有时因为实验条件、选用试剂、 稀释等存在的问题扩增效率还有可能高过 100% 。扩增效率可以通过标准曲线来计算出来， 它只和标准曲线的斜率有关。 PCR 扩增效率 = 10 (-1/slope) 1
