1、 番茄 SlPYL/SlPP2C/SlSnRK2 基因家族对ABA 和渗透胁迫的响应及 SlSnRK2s 基因的功能研究1 绪 论1.1 问题的提出及研究意义自然条件下，植物受到多种不良环境的影响，比如高温、低温、干旱、高盐、辐射、病害等。其中，干旱和高盐能够引起渗透反应，是逆境胁迫中的重要形式，对农业生产的影响极其严重，同时也是很多地方农业发展的重要制约因素（Longand Ort, 2010）。因此，筛选植物在渗透胁迫应答反应中的重要响应因子，对研究植物的胁迫应答反应通路，提高植物的抗逆性，保障安全生产具有重要的意义。脱落酸（abscisic acid，ABA）是 20 世纪 60 年代发
2、现的一种植物激素，最初因为能促进叶片脱落而得名。然而随着最近几年来的研究发现脱落酸不仅参与种子休眠（Finkelstein, 2002）、果实成熟（Lund et al. , 2008）、影响气孔关闭 (Bartelsand Sunkar, 2005），还参与植物的干旱、盐、病害、高低温等胁迫反应 （Bray, 1988;Zhu, 2002; Reddy et al.，2004; Shinozaki and Yamaguchi, 2006），是植物中一种重要的胁迫激素 。研究还发现，在水分胁迫下，ABA 含量上升，促使保卫细胞气孔关闭，调控一些基因的表达，从而减少植物在渗透胁迫下的伤害（Adi
3、e et al., 2007）。ABA 信号通路是一个复杂的系统，2009 年以前，人们对它的调控机制和途径不是很清楚，直到两个独立的研究小组发现了 ABA 受体，才使得 ABA 的相关研究取得突破性进展（Ma et al., 2009; Park et al., 2009）。ABA 信号转导途径主要包括个核心成分：ABA 受体PYR/PYL/RCAR，负调控因子2C 类蛋白磷酸酶（PP2C ）和正调控因子SNF1 相关蛋白激酶 2 （SnRK2），它们共同构成一个双重负调控系统 （Umezawa et al., 2009; Vlad et al., 2009; Fujii et al., 2
4、009）。然而这三个基因家族每个家族都包括若干基因，在这些基因中哪些参与了信号通路的转导，哪些是通路中的重要基因，哪些又与逆境应答响应有关，目前尚不清楚，需要深入研究。1.2 国内外研究现状PP2Cs 基因最初是在拟南芥中从 ABA 不敏感突变体中分离得到的，命名为 ABA-INSENSTIVE1（ABI1）和 ABI2，这些突变体在植株发育的不同时期和不同组织中都表现出 ABA 不敏感性（Leung et al., 1994; Rodriguez et al., 1998）。随后分离得到的 HAB1 和HAB2 与 ABI1 高度同源，能被 ABA 诱导表达（Saez A et al., 2
5、004），Nishimura 等人（2007）从对 ABA 超敏感突变体中分离出AtPP2CA。当上述基因的功能一旦缺失，就表现出 ABA 超敏感性，说明 PP2Cs 基因在 ABA 信号通路中起到了负调控的作用（Hirayama and Shinozaki, 2007）。拟南芥中 PP2C 含有 76 个基因，可以分为 A-J 10 个类群，但是只有 A 类群与 ABA 信号转导有关。A 类群包括了 ABI1，ABI2，HAB，AHG 和 PP2CA 类等 9 个成员（Schweighofer et al., 2004）。植物体内不同的组织器官中 PP2CsA类基因的作用和表达模式是不同的，
6、例如 ABI1 在不同的组织中都有表达，包括种子和保卫细胞，而 AHG1 和 AHG3/AtPP2CA1 主要在种子中表达，亚细胞定位也表明 ABI1 主要定位于细胞核和细胞质，而 AHG3/AtPP2CA1 只定位于细胞核（Yoshida et al., 2006; Nishimura et al., 2007）。这些差异导致了 ABI1 能调控不同的组织对ABA 的响应，而 AHG3/AtPP2CA1 主要在种子中发挥作用，并在细胞核中调控基因的表达（Leung et al., 1994; Yoshida et al., 2006; Nishimura et al.,2007）。研究发现超
7、表达 HAB1 能破坏气孔的关闭，抑制 ABA 诱导基因的表达，植株抗旱性减弱（Alois et al., 2004）。AtPP2C 能被干旱、低温、盐诱导表达，抑制表达能增强植株的抗冻性，促进生长（Kuhn et al.,2006; Tahtiharju and Palva, 2001）。在拟南芥中超表达山毛榉的 FsPP2C1 基因，转基因种子休眠程度降低，对 ABA 和非生物胁迫敏感性增强，植株出现了矮化和花期延迟的现象（Reyes et al., 2006）。2 番茄 SlPYL、SlPP2C 、SlSnRK2 基因对 ABA 和渗透胁迫的响应2.1 材料和方法野生型番茄（Solanu
8、m lycopersicum，cv Micro Tom），实验温室内种植，种植条件为光照 16 h，温度 252，黑暗 8 h，202，湿度为 80%左右。DNA Maker、50 TAE 电泳缓冲液购自 Promega 公司；Trizol 试剂购自 Invitrigen 公司；反转录试剂盒购自购自 Fermentas 公司；其他化学试剂（如氯仿、异丙醇、氯化钠等等）购自重庆鼎国公司，定量引物由金思瑞合成，序列如表 2.1。将野生型番茄种子灭菌后播种在 1/2 MS 培养基上，2 周以后挑选生长状态差不多的幼苗移栽到温室，一个月以后做处理。将植株分为 4 组，每组 12-15 颗苗。第一组做对
9、照，采集叶片，用液氮速冻，保存于-80。第二组用 100 M ABA 处理，第三组用 150 mM 的 NaCl 处理，于 24 h、72 h 采集样本。第四组连续两周不浇水直到萎蔫，收集叶片，保存同前。将得到的 RNA 稀释 50 倍后，测 RNA 纯度，即OD260/OD280 值，比值在 1.8-2.0 的保存备用。取 1 L RNA 凝胶电泳进一步验证，得到三条带，28S, 18S, 5S, 28S 的亮度应为 18S 的两倍。2.2 结果及分析2.2.1 SlPYL, SlPP2C, SlSnRK2 的序列分析根据数据库提交的完整的基因序列，分离得到 9 个 SlPYL 基因，命名为
10、 SlPYL1、SlPYL2、SlPYL4-SlPYL10 ；6 个 SlPP2C 基因，分别命名为 SlABI2-1，SlABI2-2，SlHAB,SlPP2CA1-SlPP2CA3；7 个 SlSnRK2 基因，命名为 SlSnRK2.1-2.7。预测 SlPYL 编码的氨基酸有 123-218 个，SlPP2C 有 397-544 个，SlSnRK2 有 140-362 个。序列分析表明（图 2.1），SlPYL, SlPP2C, SlSnRK2 保守性较高：SlPYL 含有 ABA 结合位点，能与 ABA 结合；SlPP2C 能与 SlPYL 结合，同时含有 Mn2+、Mg2+结合位点
11、，能在 Ser /Thr 残基上去磷酸化。根据系统发育分析（图 2.2）和相关报道（Ma er al.,2009; Hrabak et al., 2003），SlPYLs 和 SlSnRK2s 基因家族可以分为三个亚家族或者三个亚类。在 SlPYL 基因家族中 SlPYL4, SlPYL7, SlPYL8 和 SlPYL9 属于亚家族,SlPYL5, SlPYL6 和 SlPYL10 属于亚家族,剩下的属于亚家族 。在 SlSnRK2 中，第一亚类包括了 SlSnRK2.5, SlSnRK2.7，第二亚类包括 SlSnRK2.4，第三亚类包括 SlSnRK2.1,SlSnRK2.2,SlSnR
12、K2.3 和 SlSnRK2.6。SlPP2Cs 基因都属于 PP2CA 类亚家族。3 番茄 SlSnRK2s 基因克隆、表达分析及定位. 253.1 实验材料和方法 . 253.2 结果及分析. 303.3 讨论. 363.4 本章小结. 364 SlSnRK2s 基因载体的构建及遗传转化 . 374.1 材料和方法. 374.1.1 实验材料. 374.1.2 实验方法. 384.2 结果与分析. 424.2.1 超表达载体构建及遗传转化 . 424.2.2 SlSnRK2.1/2.2/2.3 干扰载体构建及遗传转化. 454.3 讨论. 474.4 本章小结. 475 转基因番茄表型分析
13、及基因功能研究. 495.1 材料和方法. 495.1.1 实验材料. 495.1.2 实验方法. 495.2 结果与分析. 525.2.1 超表达转基因植株分析研究 . 525.2.2 RNAi 干扰转基因植株分析研究. 575.3 讨论. 605.4 本章小结. 615 转基因番茄表型分析及基因功能研究5.1 前言ABA 能促进种子休眠，抑制萌发。拟南芥中，SnRK2.2 和 SnRK2.3 双突变体表现出 ABA 不敏感性，发芽率提高，休眠程度降低（Fujii et al.,2007），ABA 不敏感突变体 abi3 和 vp1 在即使有抑制剂存在的情况下也能萌发（Beweley, 19
14、97）。野生型植株中用 ABA 处理后，SnRK2.1 和 SnRK2.2 被下调表达，说明对 ABA 是敏感的。超表达后敏感性增强，使得转基因种子的萌发率明显比野生型低。这也说明 SlSnRK2.1 和 SlSnRK2.2 在 ABA 信号转导过程中扮演了重要角色。在含 NaCl 的培养基上，转基因种子基本不萌发，萌发的幼苗生长状况也很差，相比较于野生型番茄，转基因种子表现为抗盐能力下降，抗性减弱，因此认为 SlSnRK2.1 和 SlSnRK2.2 在抗逆信号通路中起到负调控的作用。植 物 在 逆 境 环 境 下 受 到 伤 害 后 ， 脂 膜 会 发 生 过 氧 化 反 应 ， 丙 二
15、醛（(Malondialdehyde malonic dialdehyde, MDA）作为一种氧化反应的产物从膜上释放出来，与核糖核酸、功能蛋白相互作用，改变它们的构象或产生级联反应，最终导致这些蛋白的功能丧失或缺失，因此 MDA 常被作为衡量植物细胞膜伤害程度的指标（Salin, 1987）。转基因植株中 MDA 含量上升，高于野生型番茄，说明转基因植物受到的伤害更大。过氧化物酶（Peroxidase，POD）和过氧化氢酶（HydrogenPeroxidase，CAT) 都是生物防御体系中的关键酶，能清除体内的活性氧，减轻细胞伤害（Fridovich, 1986; 张坤生, 2007）。结论
16、从番茄中分离出了 9 个 SlPYL 基因、 6 个 SlPP2C 基因，7 个 SlSnRK2 基因，预测 SlPYL 编码的氨基酸有 123-218 个，SlPP2C 有 397-544 个，SlSnRK2 有 140-362 个。进化分析 SlPYLs 和 SlSnRK2s 基因家族可以分为三个亚家族或者三个亚类。在 SlPYL 基因家族中 SlPYL4, SlPYL7, SlPYL8 和 SlPYL9 属于亚家族，SlPYL5,SlPYL6 和 SlPYL10 属于亚家族，剩下的属于亚家族。在 SlSnRK2 中，第一亚类包括了 SlSnRK2.5, SlSnRK2.7，第二亚类包括
17、SlSnRK2.4，第三亚类包括SlSnRK2.1,SlSnRK2.2,SlSnRK2.3 和 SlSnRK2.6。 SlPP2Cs 基因都属于 PP2CA 类亚家族。在对 ABA 的响应中， SlPYL 基因的总体表达受到不同程度的抑制，SlPYL10 影响最大；在 A 型 SlPP2C 亚家族中，ABA 诱导表达了 3 个基因：SlABI2-1、SlABI2-2 和 SlPP2CA2，SlPP2CA1被缓慢抑制；SlSnRK2 家族中，除了 SlSnRK2.1 和 SlSnRK2.7 其余基因都有响应，参与了 ABA 应答调控。在盐胁迫时，除了 SlPYL1 和 SlPYL7 影响不明显，其它基因都有不同程度的上调或下调表达，参与了盐胁迫的响应；A 型 PP2C 家族中，除了 SlPP2CA2 基因在 72h 时有小幅度的上调表达，几乎所有的 SlPP2C 基因都被盐胁迫所抑制，变化最显著的是 SlHAB 和 SlPP2CA1；SlSnRK2 家族的 7 个成员在盐胁迫下基因表达发生了显著变化。
