1、Seahorse,汇报人： 学号：,背景,生物能量学（Bioenergetic） 探讨的是生物将氧份转为能量并借此推动生命的过程。不同的细胞依据其生理特性及健康状况，能量供需系统亦有所不同。,简介,美国海马生物科学利用细胞外流量（Extracellular Flux，XF）检测专利技术，发明了业界第一款海马细胞能量代谢实时测定仪/生物能量代谢测定仪（Seahorse XF Extracellular Flux Analyzers），是进行细胞代谢分析、氧呼吸测定、药物代谢分析、线粒体有氧代谢和糖酵解等功能的最佳分析工具。特点：通过特殊的细胞培养微孔板设计，在测量时临时形成的约2ul微环境中，利
2、用无创的专利光学传感器同步地实时探测溶解氧（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）变化，从而快速了解细胞内两大能量转换途径（线粒体的有氧代谢和糖酵解）的能量代谢状态。,仪器外观,Hydro Booster,Sensor Cartridge,Cartridge Lid,耗材,自动药物注射端口 启用实时功能分析,Cell Mito Stress Test Assay Kits,水化探针,1.在Utility Plate每孔中加入1ml校准液(Seahorse XF 校准液用于溶解和校准 XF 小柱，并包含 FluxPak),实验前一天,2.将Hydro Booster放在Utility Plate上，
3、Sensor Cartridge放在最上面,3.放入无CO2的培养箱，37过夜（使校准液能浸没在sensors中；保证培养箱湿度，防止干燥）,培养细胞,1.100ul培养液收集细胞，按最佳细胞密度重悬细胞（10,000 - 80,000个细胞/孔）。 2.每孔接种100 L细胞悬液，背景校正孔（A1, B4, C3, D6）不接种细胞。将细胞板室温静置在超净台上1 h。3.将细胞板放置在细胞培养箱中让细胞贴壁（快1h；慢5-6h），在显微镜下观察细胞是否贴壁。4.细胞贴壁后，每孔加入150 L生长培养液，总体积为250 L。加液时，沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。 5.将细胞放置在细胞培养
4、箱中过夜培养。在显微镜下观察细胞的生长状态。,预热仪器,打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37 ，过夜预热。,准备XF检测液,一个培养板 手动加液需100ml，仪器加液需200ml1.使用NaOH调节pH值至7.350.052.检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。3.37放置备用。,NO sodium bicarbonate Low phenol red (3 mg/L),实验当天,处理细胞,1.将细胞培养板从CO2培养箱中取出，并记录时间。 2.在显微镜下观察细胞（无污染，细胞均匀状态好，贴壁未脱落，背景矫正孔无细胞。） 3
5、.用XF细胞线粒体压力测试检测液洗细胞：a.吸去生长培养液至每孔剩余50 L。b.用1 mL XF检测液洗细胞两次。c.每孔加入检测液至终体积为500 L/孔。 4.在显微镜下观察细胞，确认细胞在换液过程中没有脱落。 5.将细胞板置于37C无CO2培养箱中1 h。,配制XF细胞线粒体压力测试盒中药物母液,将药物稀释为10浓度，用于加到加药孔中,3.取300 L 50 M rotenone/antimycin A母液至2700 L检测液中。,2.按以下表格，用检测液将FCCP稀释为不同的浓度,1.按左边表格，用3 mL 检测液将oligomycin稀释为所需浓度（或使用大多数细胞都适用的1 M）
6、。,加药,从无CO2培养箱中取出已水化的测试板。按以下说明，将药物分别加到每个加药孔里。 加药孔A：细胞孔内oligomycin终浓度为1 M。每个A孔加入56 L 10药物。 加药孔B：测定浓度的FCCP。将62 L 10的不同浓度药物加入到B孔里。 加药孔C：细胞孔内Rot/AA终浓度为0.5 M。每个C孔加入69 L 10药物。,选择模板（提前预热）,Injection strategies-add-strategy 1-A-add-mito stress test1,B C同样,Pretreatment-add-不用做修改,Assay Media-Mito Stress test me
7、dium,填写相关信息：Name ,Cell Type, Seeding density（Cell Type2，3， 4 同样），之后点击“Generate Group”查看,“Plate Map”设置颜色,默认的 Mix-Wait-Measure时间为3 min-2 min-3 min。通常在加药前测量3次基础值；每次加药后再进行3次测量。“Injection”多少种药点多少次,Review Run-Plate Information-Well Volume-Plate by-Start Run，放入测试板。当软件出现校准完成提示时，将Utility板换为细胞培养板。点击Continue。仪
8、器完成OCR值测定，数据分析。,寡霉素：ATP合酶抑制剂； FCCP：解偶联剂 ； 抗霉素A/鱼藤酮：呼吸链抑制剂；,How do I know whether the cell density is good?, Basal OCR range: 20-160 pmol/min Maximum recommended OCR: 400 pmol/min ECAR: 5-100 mpH/min,优势特点：,采用超敏感的生物传感器和非接触式设计，真正实现检测细胞零损伤； 实时检测细胞有氧呼吸、糖酵解的能量代谢情况，即时反应细胞生理状态； 同步检测细胞的耗氧量和产酸率（pH值变化），数据结果更加全面； 实现同步检测96/24个细胞样品，通量高，速度快； 自动化检测流程、自动化控制添加多达四种药物，操作方便高效。,Thank you,
