1、蛋白层析系统,李秀男Email: 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室,主要内容,1.概述 2.蛋白层析系统的组成 3.输液系统 4.进样系统 5.检测系统 6.日常维护 7.选型购买,1 概述,液相色谱（层析）的发展 古罗马时期人们用布或纸分析染料与色素； 1903年，Tsweet发表首篇有关层析的论文； 1960s, HPLC商用仪器出现 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法,层析分类,2. 蛋白层析系统的构造,输液系统： (1)提供连续、稳定而精确的流量； (2)进行梯度洗脱；进样系统：引入样品层析柱检测系统：对分离后各组份进行检测给出响应信号，并进行处理 产品收
2、集系统：收集分离产物,构造简图,六通阀,AKTA组成示意图,堆积型,GradiFrac (GE),国产,简单整合型,AKTA Prime (GE),BioLogic LP (Bio Rad),复杂整合型,AKTA Explorer (GE),BioLogic LP (Bio Rad),按规模分,实验室规模 AKTA pure 流速150mL/min,中试规模 AKTA pilot 流速4-400mL/min,生产规模 AKTA process 流速0.75-30L/min,3 输液系统,流动相输送方式 高位槽 气体压力 出口抽真空 泵送系统 蠕动泵 柱塞往复泵 其他类型的泵，如隔膜泵,最常用,
3、梯度混合方式 梯度混合器 电磁阀（低压梯度） 高压梯度,最简单的方式,压力,真空,高位槽,蠕动泵,蠕动泵（软管泵）工作原理,优点：结构简单，无密封件，无阀门维护方便，易于清洗和清洁可输送含颗粒液体以及高粘流体很好的自吸功能，可干转剪切力小，适合输送对剪切力敏感的物料 缺点：精度差脉动大压力低,蠕动泵类型,单通道泵,多通道泵,柱塞往复泵特点,耐高压 脉冲小 流量宽、无极可调 重复性好、准确度高,柱塞泵工作原理,单向阀结构,球座,工作原理,柱塞泵分类,按柱塞个数 单柱塞 双柱塞 三柱塞 按工作方式 并联泵 串联泵,偏心轮双柱塞并联泵,偏心轮,通过每圈不同阶段电机转速控制,控制要求较高 AKTA做到
4、了,凸轮双柱塞并联泵,理论速度曲线,加工精度为0.01mm时的速度曲线,加工精度要求较高,柱塞泵的操作注意事项,柱塞杆和密封圈 缓冲液泄露会导致盐析出，损伤柱塞杆和密封圈 使用20%乙醇作为泵后清洗液 保持流动，并定期检查是否流空或者长菌 使用完高盐溶液后用纯水冲洗至少半个小时 单向阀 最怕堵塞 流动相用0.45um膜过滤 超纯水和色谱纯试剂可以直接使用,隔膜泵,生产规模设备常用 特点：低剪切、大流量,德国QuattroFlow四元隔膜泵,AKTA process三元隔膜泵,梯度洗脱系统,梯度混合器,低压梯度,B,A,B,A,高压梯度,梯度混合器,两杯液位始终保持平衡； 两杯溶液混合速度以及输
5、出流量均可调节，可以作出各种不同斜率的线性梯度； 按不同阶段的时间作适当的输出流量调节，还可以做出各种不同的台阶形梯度。,低压梯度,通过电磁阀的分时切换来实现流动相梯度,A,B,高压梯度,如何考察梯度混合性能,简单判断梯度比例阀是否泄漏 设定泵使用一个单独通路（如A），泵出口排空，开大流速，观察其他通路（B等）的流动相是否流动，正常时均不应流动。 综合考察梯度性能 流动相A：水；流动相B：1%丙酮 不接层析柱，280nm检测，编辑梯度，设定流速，不进样进行检测,AKTA梯度性能考察,A：水 B：0.5-1.0%(v/v)丙酮,蛋白质的梯度洗脱注意事项,层析过程优化采取梯度洗脱或者阶越式洗脱方式
6、； 反相层析探索条件时，梯度应尽可能长（20个柱体积）； 当发现进错样时，不可以为了节约时间，而直接用100%流动相B（有机相）洗脱，否则会不可逆地损坏层析柱。,4 进样系统,手动进样 直接倒入柱子顶部 进样阀进样 自动进样 泵进样 柱切换进样,进样阀,手动进样阀自动进样阀,定子（Stator）,转子（Rotor）,AKTA进样阀操作,手动进样注意事项,进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒吸清洗：在Inject状态清洗进样口 对于Rheodyne进样器 一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。废
7、液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸,进样阀操作注意事项,进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露 缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造成漏液和两个导流槽之间短路 实验完成后用纯水在load和inject状态下清洗，20%乙醇保存 使用完高盐溶液后用纯水冲洗 至少半个小时,定子（Stator）,转子（Rotor）,自动进样,进样动态范围广 样品残留少(连续洗针系统) 延迟体积少 进样重复性高( 0.5% RSD) 主要应用于分析型色谱,泵进料,针对料液中目标产物浓度极低，料液体积较大的情况（如用离子交换捕捉发酵液中表达量非常低的基因工程蛋白质）； 料液前处理非常
8、重要，进料前必须用0.45 m或更小孔径滤膜严格过滤； 进料过程必须密切注意压力变化； 推荐使用蠕动泵进料。,柱切换进料,解决下列问题 人工换柱带来的泄漏和污染 周期长导致蛋白质失活 通量低和收率低,多柱组合层析,多柱组合层析纯化蛋白质实例,白蛋白、AT-、运铁蛋白均达到了电泳纯（纯度99%） 1-AT和结合珠蛋白（两个条带）的纯度也在95%以上 整个过程用时140分钟采用收集洗脱峰，人工换柱层析，则至少需要3天,5 检测系统,光学检测器（如紫外-可见、荧光、示差折光、蒸发光散射、多角度激光散射等） 热学检测器（如吸附热等） 电化学检测器（如pH、极谱、库仑、安培等） 电学检测器（如电导等）,
9、古老的方法：目测、离线显色反应,目测法,色谱名称的由来 最古老原始的方法 在玻璃柱中观察带颜色物质形成的条带,显色反应,没有在线检测器 针对一些没有紫外吸收的物质，如多糖，PEG等 设备要求低 工作量大,紫外-可见检测器,主要组成部分 光源 分光系统 样品池 光强探测器 分类 固定波长检测器 可变波长检测器 单波长检测器 多波长检测器 二极管阵列检测器,纵坐标为吸光度A，横坐标为时间作出的曲线即为层析图谱,固定波长紫外检测器,汞灯光谱图,滤光片原理示意图,固定波长紫外检测器,Pharmacia UV Monitor UV-1 AKTA PRIME和UPC所配检测器,国产8823B,汞灯为光源，
10、荧光片和滤光片来选择波长，通常为254和280nm，分别用于核酸和蛋白的监测 结构简单，价格较便宜 可配套国产色谱工作站（如N2000）进行数据采集,可变波长紫外-可见检测器,氘灯光谱图,钨灯光谱图,氘钨双光源光谱图,AKTA检测器,氙灯光谱图,氙灯作为光源 优点：全波长、光强高 缺点：脉冲灯，每次闪耀光强不一样,二极管阵列和CCD检测器,紫外检测器光源,一台AKTA 开灯后，每小时光源烧掉10元，如果加上光栅的损耗（60,000 元/3000 hr），每小时耗费30元，一天（8小时）为240元，一个月（20天）为4800元； 为节省操作费用，必须注意： 装填、平衡或者冲洗层析柱时不需要开灯；
11、 完成实验后冲洗系统前把紫外灯关闭；,AKTA紫外可见检测器 操作注意事项,汞灯、氘灯、钨灯使用寿命和点燃次数相关 氙灯寿命与使用时间有关，和点燃次数无关 因此，在不必要的时候，例如装填、平衡或者冲洗层析柱时随手关灯 多波长检测时，光栅一直处于旋转状态，两个波长差别越大，旋转角度越大，影响寿命 因此，如无特殊需要，最好使用单波长检测,6.维护每天,系统 清洁擦拭外表，防止试剂或结晶的盐腐蚀设备 溶液和样品必须过滤 检查系统管路和接头有无破损，系统是否渗漏。 使用完毕，须用水将系统冲洗干净，之后用20%乙醇清洗系并保存所有的流路。,pH计 使用前校正pH计。 用后将pH计拆下放入保护液（1:1
12、pH 4 buffer和 2 M KNO3，或pH4.0的饱和KCl溶液）。,泵 检查泵头周围是否渗漏，如果泵头有渗漏,或是流量不准确，则需更换泵头密封圈。 更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。,维护每周,在线滤器清洗过滤片，如有必要须更换过滤片，否则会形成很高的在线压力，流速降低。,泵冲洗系统 更换泵后冲洗液（20%乙醇）。 如果冲洗液瓶中液体量增加，说明泵头密封圈渗漏，须更换。 如果冲洗液不循环，说明单向阀堵塞或损坏，需要清洗或更换。,缓冲液筛网检查入口溶液的筛网是否很脏，如有必要须更换。,维护每月,系统清洗 按时清洗系统或在遇到问题时清洗系统。用1M NaOH
13、，执行SystemWash指令，之后立即用水将NaOH冲洗干净。 检查泵头单向阀工作是否正常。,在位清洗根据样品的脏/干净的程度，可按软件中CIP程序定期清洗系统，防止系统管道被堵，压力增高。11,维护每半年,紫外可见检测器 用注射器推10%的表面活性剂SDS注入紫外流动池 停留20分钟，用水冲洗。 用用注射器推甲醇或1M NaOH注入紫外流动池，停留20分钟，用水冲洗。,pH/电导检测器清洗流动池：拆下pH电极，用1M NaOH清洗pH和电导流动池30分钟，用 水冲洗。 清洗pH电极（响应慢或校正斜率小于80%时）：1. 盐沉积：0.1M HCl/ 0.1M NaOH/ 0.1M HCl 交替洗数次，间隔5分钟。2 . 油脂沉积：1%SDS清洗后水洗。3. 蛋白沉积：1% 蛋白酶于0.1M HCl 溶液中清洗后水洗。,压力检测器零点校正（pressure offset)。,7.蛋白质层析系统选择,明确自己的目的，工艺探索？方法验证？ 不要盲目崇拜仪器的性能，够用即可； 从最简单的仪器做起，培养自己的适应能力和动手能力。,例如：蠕动泵+单波长检测器+N2000色谱工作站+电脑,国内外公司,GE BIORAD 北京创新通恒 天津博纳艾杰尔 上海沪西 苏州/上海利穗 上海金达 苏州荣捷 国家生化工程技术研究中心（北京） 其他的欢迎补充,谢谢大家！,
