1、第三章 蛋白质化学,卢晓英西南交通大学 生物医学工程专业,生物化学B精品课程网站 http:/ 蛋白质化学,第一节 蛋白质概述第二节 氨基酸第三节 肽第四节 蛋白质的一级结构第五节 蛋白质的高级结构第六节 蛋白质的结构与功能第七节 蛋白质性质与分离提纯,第一节 蛋白质概述,蛋白质是生命的主要体现者。没有蛋白质，就没有生命。一、蛋白质的生物学功能,催化功能 运动功能 结构功能 防御功能 运输功能 调节功能 贮存功能 信息传递功能 遗传调控功能 其他功能,二、元素组成 蛋白质中都有C, H, O, N, 还含有S、P、Fe、Cu、Mn、Zn、Mo等元素。大致含量为： C 5055% O 2024
2、N 16% H 68 S 04 P 0.40.9% 其他 微量 蛋白质平均含N量为16%凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算基础。 蛋白质含量(g)蛋白含氮量6.25 （100/16=6.25，称为蛋白质悉数或蛋白质因数）,二、蛋白质分类按在体内的生物作用分类结构蛋白、功能蛋白按分子形状分类球状蛋白：外形似球体，分子长度与直径比一般小于10，多溶于水。纤维状蛋白：外形细长，分子轴比大于10。分子量大，不溶于水。按分子组成分类简单（单纯）蛋白：全由AA组成，不含非蛋白成分如血清清蛋白等。4类：清蛋白和球蛋白，谷蛋白和醇溶谷蛋白，精蛋白和组蛋白，硬蛋白结合蛋白：由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根
3、据辅基不同，可分为5类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、色蛋白,三、蛋白质水解,蛋白质水解主要有三种方法：酸水解、碱水解和酶水解。（一）酸水解 回流煮沸 蛋白质 氨基酸 HCl或H2SO4优点：水解彻底，最终产物为L-氨基酸，无旋光异构体产生。缺点：色氨酸（含吲哚基）完全被破坏； 含羟基的丝/酪/苏氨酸有部分破坏； 天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解； 如样品含有杂质，在水解中常产生腐黑质，使水解液变黑。,（二）碱水解（一般很少使用）毛发酱油 蛋白质 氨基酸 优点：色氨酸（含吲哚基）不被破坏，水解液清亮。缺点：产生旋光异构体: D-（不易被吸收）和L-型aa； 丝/苏/赖/胱氨酸等大部分被破坏；
4、（三）酶水解优点：不破坏氨基酸，也不引起消旋。缺点：水解时间长，水解中间产物较多。 一般用于部分水解，若要完全水解，需用多酶协同作用。,回流煮沸10-20h 5M的NaOH,第二节 氨基酸,蛋白质基本组成单位是氨基酸(amino acid，简称 AA)。一、氨基酸结构,AA有D-型和L-型两种异构体，也有(-)或(+)的旋光性。天然蛋白质的aa都是L-型，且多数是(+)的。,二、常见氨基酸 已知蛋白质由20种常见AA组成。构成蛋白质都是L型的AA。,吲哚基,咪唑基,胍基,甘丙缬亮异亮氨 G A V L I / GlyAlaValLeuIle 甲硫半胱丝苏氨 M C S T / MetCysSe
5、rThr 谷氨酰胺天冬酰 E- Q D- N / GluGlnAspAsn 二氨一羧赖精氨 K+ R+ / LysArg 芳香苯丙酪氨酸 F Y / PheTyr 杂环组氨色氨酸 H+ W / HisTrp( Try ) 杂环亚氨脯氨酸 P / Pro 多种氨酸记心间,氨基酸的记住方法,1.分类（1）根据R基的化学结构（1）芳香族(3)：Phe(苯丙)、Tyr(酪)、Trp(色)；（2）含羟基(2)：Thr(苏)、Ser(丝)；（3）含硫基(2)：Met(蛋/甲硫)、Cys(半胱)；（4）含酰胺基(2)：Asn(天冬酰胺)、Gln(谷氨酰胺);（5）含羧基(2)：Asp(天冬), Glu(谷)
6、；（6）含氨基(3)：Arg(精), Lys(赖)，His(组)。 （7）杂环(2)：His(组)和Pro(脯)；,（2）根据R基的极性极性氨基酸：不带电(7)：Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Cys, Gly(最弱);带正电(3)：His、Lys、Arg；带负电(2)：Asp、Glu非极性氨基酸(8)：Val, Leu, Ile, Ala(疏水性最小)脂肪链 Phe, Trp，Met, Pro （3）根据酸碱性质碱性（带正电荷）：Arg, Lys, His；酸性（带负电荷）：Asp, Glu；中性（不带电荷）：非极性AA、极性不带电荷AA,从营养学角度将氨基酸分为必需和非必
7、需氨基酸。必需氨基酸（8或10个）异亮、甲硫（蛋）、缬、亮、色、苯丙、苏、赖、精、组（合成效率低，尤是婴幼儿时期，需由外界供给半必需AA）非必需氨基酸（10个）剩余10种氨基酸，即甘、丙、丝、酪、谷、脯、天冬、天酰、谷酰和半胱。,Ile Met Val Leu Trp Phe Thr Lys His Arg 一 家 写 两 三 本 书 来 煮 经,2、特殊氨基酸非蛋白氨基酸 还有200多种AA很少参与蛋白质组成，多为蛋白质AA的衍生物。它们以游离状态或结合状态存在于细胞或组织中，常作为代谢物前体或中间产物，对生物体具有重要作用。羟脯氨酸（Hyp）：存在于胶原蛋白分子中，是至今所知唯一存在于蛋白
8、质分子中的特殊AA；磷酸丝氨酸：调节蛋白质（或酶）的生物活性；鸟氨酸、瓜氨酸：自身不能合成，是尿素生成的中间产物；-丙氨酸：泛酸及辅酶A的组成成分；D-氨基酸：低等生物细胞壁的成分，或是体内活性肽的成分。,三、氨基酸性质（一）物理性质一般物理性质 无色晶体，高熔点（200以上），一般均溶于水（胱和酪AA除外），且水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂，一般有味。2. 旋光性 除Gly外，都含C* ，有旋光性。比旋光度是AA重要物理常数之一，是鉴别各种AA的重要依据。 Thy(苏)和Ile(异亮)、Hyp(羟脯）和Cys(胱)中，除-碳原子外还含有一个C，有4种异构体：L-，D-型和
9、L-别-型和D-别-型。,3.光吸收色老笨 所有-氨基酸在可见光区都无光吸收，在紫外区(220nm)都有光吸收，在近紫外区（220300nm）只有3个带苯环的AA（因苯环上含共轭双键）有光吸收，它们分别为: Phe(苯丙) 259nm Tyr (酪) 278nm Trp,Try(色) 279nm 通常蛋白质的紫外吸收主要有后两个AA决定的，一般吸收高峰在280nm左右。以色氨酸吸收最强。 紫外分分光度法可测定蛋白质的含量。,4.氨基酸的两性解离和等电点 AA含有酸性的羧基和碱性的氨基，因此AA是一种两性电解质。AA带电情况取决于它所处的酸碱环境。,pHpI,pH=pI,AA在水溶液或结晶态时，
10、均以兼性离子（或称偶极离子）的形式存在。在同一AA分子上带有能放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子，为两性电解质。 在生理pH值时，大多AA以两性离子为主存在。 调节溶液pH，使AA分子上的NH3+基和COO-基的解离程度完全相等，即所带净电荷为零，此时AA所处溶液的pH值称为该AA的等电点（Isoelctric point，pI）。 由于静电作用，在PI时，AA的溶解度最小，容易沉淀。利用这一性质可分离制备某些AA。,通过对AA的酸碱滴定，可计算PI值。以甘氨酸为例：,左段：转折点pK12.34时，说明两性Gly中COO-已有半数被中和，此是Gly中的COOH的解离常数；右段
11、：转折点pK29.60时，说明两性Gly中NH3+已半数被OH-中和，此是两性Gly的NH3+的解离常数。解离常数(pK)：质子供体与质子受体浓度相等时的pH值。PI值相当于AA的两性离子状态两侧基团pK值的算术平均数。,根据pK值来计算PI值： 等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。 侧链不含离解基团的中性AA，其PI值是它的pK1和pK2的算术平均值： pI = (pK1 + pK2 )/2 侧链含有可解离基团的AA，其pI值也决定于两性离子两边pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2
12、 酸性AA的 pI值较小（24），如Asp和Glu；碱性AA的 pI值较大（711），如Lys，Arg和His；中性AA的 pI值7，一般在pH6左右。,（二）化学性质,与亚硝酸反应与甲醛反应酰化反应脱氨基反应西佛碱反应成盐反应Sanger反应,成盐成酯反应酰卤化反应脱羧反应成酰胺反应,侧链反应巯基，羟基，咪唑基,茚三酮反应,（一）由氨基参与的反应1. 与亚硝酸的反应,Lys(赖)的-氨基与亚硝酸的作用速度比与-氨基的速度慢的多；Pro(脯)亚氨基、Arg(精)、His(组)、Trp(色)等都不与之作用;经典的范斯莱克定氮（Van Slyke）法测定蛋白质含量。生产中，常用来测定蛋白质的水解程
13、度。,2.与甲醛反应,用碱来滴定AA羧基时，由于氨基和羧基相距较近，使得到滴定终点AA也没完全分解，不能准确滴定。但当AA氨基与甲醛反应后，能将氨基保护使其不生成两性离子，使其酸性增强。可用酚酞作指示剂用NaOH来滴定来测定氨基酸的量。又称甲醛滴定法，是生物化工产品、食品和发酵物等生产中氨基氮的测定原理和方法。,二羟甲基氨基酸,3.酰化反应 能与酰氯或酸酐作用。,这是人工合成多肽过程中保护氨基的常用方法。,4.脱氨基作用,脱氨酶,转氨酶,5.与2,4二硝基氟苯(DNFB)的反应,AADNFB+ 多肽 蛋白,用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质N末端aa. 亦称Sanger反应,弱碱,黄色,二硝基苯氨
14、酸,黄色,与异硫氰酸苯酯反应（PITC，PTC,PTH或Edman法）,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序。Edman利用PITC测定短肽的氨基酸序列，设计出“多肽顺序自动分析仪”。PITC被称为Edman试剂。,或三氟乙酸,适合测定40个aa残基的序列,取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，DNS基团有荧光，灵敏度高达110-9mol。,与5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯反应(DNS法）,6.成盐反应,氨基酸盐酸盐,7.西夫碱 (Schiff s base) 反应,西夫碱是弱碱，是AA代谢的中间产物，也是食品褐变的原因之一。,（二）由羧基参与的反应1.成酯反应,当羧基变成乙酯后，
15、羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学活性更高。氨基酸的酯化反应常在蛋白质的人工合成过程中应用。,氨基酸乙酯,2.酰卤化反应 因氨基与羧基相距太近，直接酰卤化羧基很难，需要先用一种酰化剂（如氯乙酰）来保护氨基，在用另一种酰化剂（如PCl5）使羧基酰化。生成的酰氯很活泼，易于起多种反应，因此常用于合成肽的工作中。,3.成酰胺反应,H2N-CHR-COOC2H5 + HNH2,体外,无水,有机体内：,Asp（Glu）+NH4+,Asn（Gln）,Asn（Gln）合成酶,ATP,4.脱羧反应,H2N-CHR-COOH,脱羧酶或,，Ba(OH)2,在体内代谢中，AA脱羧产生的胺具有一定生理功能。,（三
16、）氨基和羧基同时参与的反应 与茚三酮的反应：Pro和Hyp产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（0.550g）。AA的量与颜色深浅成正比。,（四）由R基产生的反应R基包括：苯环(Phe, Tyr)，酚基(Tyr)，羟基(Ser,Thr)，巯基(Cys)，吲哚基(Trp,色)，咪唑基(His)等。可用以鉴别各氨基酸。1. 巯基及-S-S-键 巯基不稳定，易被氧化成二硫键；可与苄氯、碘乙酸胺等结合，使巯基得以保护。在肽合成中常用。 二硫键可被氧化剂和还原剂打开。用氧化剂（如过甲酸，HCOOOH)打开，生成相应磺酸；用还原剂（如巯基乙醇，HSCH2CH2OH
17、）打开，则生成巯基化合物。,(1) 巯基（-SH）的性质,作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或打开.,胱氨酸,R-SH代表巯基化合物，如巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇（DTT）等。,巯基（-SH）的性质,作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒. 是蛋白质结晶学中制备重原子衍生物最常用的方法。,对羟汞苯甲酸,(1) 巯基（-SH）的性质,巯基（-SH）的性质,作用：这些反应可用于巯基的保护。,(1) 巯基（-SH）的性质,2. 羟基（OH） 丝(Ser)，苏(Thr)，酪(Tyr)和羟脯氨酸(Hyp)都有-OH，可于酸生成酯。在磷蛋白中磷酸常与之生成磷酸酯。,在蛋白质合成中，常用来保
18、护这些氨基酸的OH。,3. 酚基 酪(Tyr)氨酸的酚基与重氮化合物（如对氨基苯磺酸的重氮盐）反应，生成橘黄色化合物，这就是Pauly反应。,作用：可用于检测酪氨酸。,4.酚基,Millon反应 红色Folin反应 蓝色,与重氮化合物（如对氨基苯磺酸的重氮盐）反应棕红色。,4.咪唑基组(His)氨酸上的咪唑基，pK2值为6.0，在生理条件下有缓冲作用。咪唑基上的-NH-位可与ATP发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。咪唑基可发生烷基化反应，生成烷基咪唑衍生物，引起酶活性降低或丧失。可与重氮化合物反应生成棕红色化合物（Pauly反应），酪氨酸也具有此反应。,5. 吲哚基 乙醛酸反应：与
19、乙醛酸或二甲基氨甲醛反应，再徐徐加入浓硫酸，在两液面接触面出现紫红色环状物。这可鉴定色（Trp）氨酸，作蛋白质定性试验。,根据氨基酸的pK值，分别求出Gly、Asp、Lys和His在 pH=1.0;pH=2.1;pH=4.0; pH=10.0时所带的电荷。测得一血红素蛋白质含0.426%的铁，计算它的最低分子量。一个纯酶按其重量含1.65%Leu和2.48%Ile ，计算该酶的最低分子量。测到一个蛋白质中Trp残基占总量的0.29%，计算该蛋白质的最低分子量。下列aa的混合物在pH3.9时进行纸电泳，指出哪一些氨基酸朝正极移动，哪一些朝负极移动。 Ala，Ser，Phe，Leu，Arg，Asp
20、，His,例题,第三节 肽,一.肽与肽键一个AA羧基与另一AA氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键(peptide bond, -CONH-)，所形成化合物称为肽(peptide）。肽呈链状为肽链。肽链的方向性书写时则从N-末端到C末端.命名从N端开始，每个AA名称后加“酰”字即成。由两个AA组成肽称为二肽(dipeptide)，由多个AA（10个以上）组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基(residue)。AA残基数在100以上的称为蛋白质，100以下的称为多肽。,四肽的结构,命 名 ？,肽键是蛋白质最基本、最主要化学键，为一特殊化学键。由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用
21、电子对发生“电子共振”，使CN肽键具有部分双键的性质，不能沿CN轴自由旋转。而CO键具有部分单键性质。不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。组成肽键的原子（O-C-N-H）处于同一平面内的。肽键中CN键不能自由旋转，但羰基C和C间及氨基N和C间是可旋转的。在一个肽平面中，能自由旋转的价键有_个？,3,二. 生物活性多肽在生物体中，有许多分子量较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。在体内一般含量少。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等,1、谷胱甘肽（GSH）：全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与
22、氧化型（GSSG）两种存在形式。,谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,2.催产素和升压素9肽催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。3.促肾上腺皮质激素（ACTH）39肽4. 脑（啡）肽具有强烈镇痛作用。-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。,Leu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuC端,Met-脑啡
23、肽 Tyr-Gly- Gly- Phe- Met C端,第四节 蛋白质的一级结构,自然界存在有很多蛋白质，性质和功能都不同，这都是由其结构所决定的。 要了解蛋白质的性质，必须要了解其结构：该蛋白质是由哪些AA组成的，各AA的含量如何；了解氨基酸间是靠哪些化学键来连接起来的； 蛋白质中的氨基酸排列顺序如何；蛋白质的长链在空间的排布。,一、蛋白质的氨基酸组成即求某蛋白质中由哪些AA构成；某特定AA含量多少，分子数多少残基重量百分比或AA的分子数计算题：要求记住各AA的分子量，残基的分子量；,二、蛋白质分子结构中的化学键1、共价键 是生物大分子间最强的作用力，决定分子基本结构，是分子识别的一种方式。
24、 肽键(peptide bond)，是多肽和蛋白质的最基本、最主要的化学键。 二硫键(disulfied bond)，连接不同肽链或同一肽链不同部分的化学键。在蛋白质分子中起着稳定肽链空间结构的作用。一旦破坏，其生物活力即丧失。角蛋白所含该键最多。 酯键(ester bond), 由一AA的羟基和另一AA的羧基缩合脱水形成的酯键。,2、非共价键 （次级键或分子间力）,决定生物大分子的高级结构，在分子识别中起关键作用。（一）配位键（dative bond）由两原子间形成的共价键，共用电子对由其中一个原子提供。金属离子与蛋白质的连接往往是配位键，进而参与蛋白质分子的高级结构。如铁氧还蛋白、固氮酶铁
25、蛋白。可用螯合剂去除金属离子，但蛋白质高级结构被破坏，活性失去。（二）离子键（ionic bond）或盐键（salt linkage）由带相反电荷的两基团间的相互吸引而形成的化学键。该键可发生解离。在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性或碱性AA残基可电离形成离子，进而形成盐键。高浓度的盐、过高或过低的pH值可破坏其盐键。,蛋白质分子中离子键的形成,（三）氢键(hydrogen bond) 是由两个电负性强的原子（如F、O、N）对氢原子的静电引力所形成的弱键。它是质子给予体XH和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。 在螺旋和折叠中占有极为重要的地位，对稳定蛋白质三维构象的维护很重要。 氢键键
26、能比共价键弱，比范德华力强。键长比共价键短。当供体原子、氢和受体原子在同一直线上，氢键最强。,蛋白质分子中氢键的形成,（四）范德华力(Van der waals)一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.30.4nm时，就存在有该力。它对维持蛋白质活性中心的构象尤为重要。,(五)疏水作用(hydrophobic bond)非极性基团（疏水基团）在含水的极性环境中为避开水相而彼此靠拢产生的一种相互聚集的力。本质是范德华力。蛋白质分子中的许多AA残基侧链是非极性的，这些非极性
27、基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。高分子蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。维持蛋白质高级结构的重要决定因素.,三、蛋白质一级结构(primary structure)的测定指蛋白质分子中AA残基以肽键相连的排列序列，即AA的线性序列。一级结构中包含的共价键(covalent bonds)主要指肽键(peptide bond)和二硫键(disulfide bond)。一级结构的测定包括：多肽链数目；S键的位置和数目；每条链中AA的数目、种类及排列顺序。一级结构的书写从N-末端到C-末端，用AA的3字母
28、缩写符号或单字母符号连续排列。若用3字母符号，每个AA间用圆点隔开，若用单字母则不用圆点。蛋白质的一级结构是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。具有特定生物功能的蛋白质，其AA排列顺序是特定的。,（一）一级结构测定的原则及要求测定原则 将大化小，逐段分析，制成两套以上肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。 目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。,（1）样品必需纯（97%以上）；（2）知道蛋白质的分子量；（3）知道蛋白质由几个亚基组成；（4）测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。（5）测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量
29、。,测定要求,7,11,6,21,牛胰岛素的化学结构,例：胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过2个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。,1.多肽链的拆分；2.测定蛋白质分子中多肽链的数目；3.测定二硫键的位置;4.测定每条肽链的AA组成，并计算出各AA的分子比；5.分析多肽链的N末端和C末端；6.采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套小肽段，并将其分离开，并测定其顺序；7.确定每条多肽链的aa顺序；8.确定肽段在多肽链中的次序;9.确定原多肽链中二硫键的位置.,（二）测定步骤,1
30、.多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，可用8M尿素或6M盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,蛋白质一级结构的测定,（三）测定步骤,2.测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端AA残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,（三）测定步骤,3.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起,可在8M尿素或6M盐酸胍存在下，用过量-巯基乙醇(还原法)或过甲酸氧化法来处理，使之还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋
31、白质一级结构的测定,（三）测定步骤,4.测定每条肽链的AA组成，并计算出各AA成分的分子比。可采用各方法来测定，如Edman氨基酸顺序分析法来进行，它能从肽链N-端开始将AA残基逐一进行解离。目前用氨基酸自动分析仪，24小时即可完成。,（三）测定步骤,蛋白质一级结构的测定,Edman法解离氨基酸,5.分析多肽链的N末端和C末端多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法；N末端测定方法：Sanger法（二硝基氟苯法，DNFB法）Edman法（异硫氰酸苯酯，PITC法）DNS法（二甲基氨基萘磺酰氯法）氨肽酶法C末端测定方法肼解法（最常
32、用的方法）羧肽酶法硼氢化锂（LiBH4）还原法,蛋白质一级结构的测定,（三）测定步骤,2,4-二硝基氟苯（DNFB)在弱碱性条件下，能与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物(DNP肽链)。由于DNP肽链中的苯环与氨基间的键稳定，不宜被酸水解，因此再用酸水解，得到黄色DNP-AA和游离的所有AA混合物。只要鉴别所生成的DNP-氨基酸，就可得知N-末端氨基酸。DNP-AA能用乙醚抽提分离。不同的DNP-AA可用色谱法进行鉴定。,二硝基氟苯法（Sanger法，DNFB法）,N末端基氨基酸测定,黄色,pH8.59,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS-Cl）可与N-端氨基酸的游离氨
33、基作用，得到DNS-肽链；再用恒沸的6M的HCl在105下水解，得到DNSAA。可直接电泳，层析或荧光检测。由于DNS-AA有很强荧光性质，故检测灵敏度比DNF法高得多。,丹磺酰氯法（DNS法）,N末端基氨基酸测定,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同反应时间测出酶水解所释放出AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。实际上此法在测定N一末端及残基序列有许多困难，困为酶对各种肽键敏感性不一样。常常难以判断哪个残基在前，哪个残基在后。最常用氨肽酶是亮氨酸氨肽酶(LAP)。该不只能水解以Leu为N-末端残基的肽键，而是
34、水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。,氨肽酶(amino peptidases)法,N末端基氨基酸测定,在蛋白质或多肽的氨基酸序列测定中，经常会碰到N末端残基的氨基被封闭。因此不能与Edman降解试剂（PITC）发生作用。N-末端残基受封闭的种类很多。例如焦谷氨酰环化、乙酰化以及某些环状肽（如短杆菌肽S）N一末端和C一末端连接成环等。如果遇上肽链N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用焦谷氨酸氨肽酶处理，它是专门裂解焦谷氨酸N末端的外肽酶。其裂解反应如下：,N末端基氨基酸测定,氨肽酶(amino peptidases)法,测定多肽链C-末端最常用方法。多肽与肼在无水条件下加热，除C-末端AA外，
35、其余AA都转变成相应的酰肼化合物，与能苯甲醛缩合成不溶于水的物质，而与C-端氨基酸分离。或者把肼解下来的C末端的AA借助DNFB试剂转变成黄色的DNP-AA，再用乙醚提取并层析鉴定。在该过程中，Cys，Asn和Gln在肼解中被破坏而不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸。,肼解法,C末端基氨基酸测定,一种肽链外切酶，从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。常用的羧肽酶有A,B,C和Y四种。A和B来自胰脏；C来自植物或微生物；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro、Arg和Lys以外的所有C-端aa；B水解C-端为A
36、rg和Lys的肽键。C和Y能水解所有C-端aa。,羧肽酶(carboxypeptidase)法,C末端基氨基酸测定,多肽的C-端可被LiBH4 还原成氨基醇，用层析法可鉴定aa的种类。Sanger早期测定胰岛素C末端的aa就是采用的此方法。,硼氢化锂（LiBH4）还原法,C末端基氨基酸测定,6.肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来，并测定其顺序。,多肽链断裂法：酶解法化学法,（三）测定步骤,蛋白质一级结构的测定,Trypsin ：R1=赖Lys和精Arg侧链；主要专一水解碱性AA，水解速度快。R2=Pro 水解受抑。,胰蛋白酶
37、, 酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶，葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶等。,水解位点,肽链,Chymotrypsin：R1=Phe苯丙, Trp色,Tyr酪时水解快;主要水解带芳香环的AA；R2=Pro水解受抑。,肽链,水解位点,糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）,Pepsin：R1和R2Phe, Trp色, Tyr酪; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,多肽链的选择性降解,化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，能选择性地切割由Met的羧基所形成的肽键。,
38、化学法：可获得较大的肽段羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-间的肽键以及-Asn-Ala-间的肽键。,多肽链的选择性降解,8.确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。,（三）测定步骤,蛋白质一级结构的测定,示例(十肽的水解),A法水解得到四个小肽： A1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-ValB法水解得到四个小肽： B1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr-His-Val,整条肽段的顺
39、序：,若N-末端为Val，则肽链顺序如何？若N-末端为Ala，则肽链顺序又如何？,Ala-Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Tyr-His-Val,示例第一套肽段 第二套肽段OUS SEOPS WTOUEOVE VERLRLA APSHOWT HON-末端残基H C-末端残基S氨基酸顺序怎样排列？,H O W T O U S E O V E R L A P S,9.测定多肽链中二硫键的位置一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术（或对角线电泳）分离出各个肽段。将混合肽短点到滤纸中央，在pH6.5下第一次电泳；滤纸暴露在过甲酸蒸汽中，使S-S氧化为磺酸基；滤纸
40、旋转90后，在与第一次完全相同条件下进行第二次电泳，确定二硫键的位置。因为胃蛋白酶的切点多，专一性低，生成的肽短小，易于后期的鉴定和分离；该酶作用pH在酸性范围，有利于防止二硫键发生交换而造成的麻烦。,蛋白质一级结构的测定,（三）测定步骤,+,-,+,-,第二向,第一向,Brown和Hartlay对角线电泳图解,pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段,采用胃蛋白酶水解：切点多，酸性环境下防止二硫键发生交换;所得肽段可利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。,ab,S,S,S,S,S,S,胰岛素,HOCH2CH2SH,SH,SH,SH,SH,SH,SH,SCH2
41、C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,ICH2COOH,二硫键的断裂,巯基(-SH)的保护,上述蛋白质测定方法称为重叠法，这是F. Sanger第一个进行蛋白质一级结构测定时建立的。后又沿用Edman发明的降解方法。但其测定的灵敏度和精确度有限，后又进行一系列的改进，如采用放射性同位素、荧光基团或有色Edman试剂，或采用新型AA序列仪，高压液相色谱等。对于蛋白质一级结构的测定已做到自动化，主要采用是Edman降解法原理设计的自动顺序分析仪器蛋白质序列仪。目前采用的有固相序列仪、气相序列仪、液相序列仪等类型。用这些仪器已测定了150
42、0多种蛋白质一级结构，并建立了蛋白质序列库。,四.蛋白质一级结构举例 （1）胰岛素（Insulin）,A链,B链,一个链内二硫键和两个链间二硫键分子量5700,A链21个aa残基,B链30个aa残基,（2）牛胰核糖核酸酶（RNase） 一条多肽链，124个AA残基组成，4个链内二硫键，分子量12600。 它是测出一级结构的第一个酶分子。,下面是一个多肽，用胰凝乳蛋白酶处理以后，可以得到哪些片断？如对其水解产物再用嗅化氢处理，可得到哪些产物？ Val-Ala-Lys-Glu-Glu-Phe-Val-Met-Tyr-Cys-Glu-Trp-Met-Gly-Gly-Ala下面是一个16肽,用胰蛋白酶
43、水解这个16肽，可以得到哪些片断？ Leu-Met-His-Tyr-Lys-Arg-Ser-Val-Cys-Ala-Lys-Asp-Gly-Ile-Phe-Ile,例题,例题,某一肽链经酸水解后，分析其组分含5种AA，其N段极易环化。经CNBr处理后得一游离的碱性AA，Pauly反应呈阳性。若用胰蛋白酶作用则得两个肽段；其一为坂口反应阳性，另一在280nm有强吸收，并呈现出Millon氏反应。此肽的AA排列顺序。,五肽序列：GluArgTyrMetHis,八肽组成为Asp、Ser、Gly、Ala、Met、Phe、Lys2。 FDNB与之反应再酸水解，得DNP-Ala；胰凝乳蛋白酶消化后分出一个四肽，其组成为Asp、Gly、Lys、Met，此四肽与FDNB反应生成DNP-Gly；胰蛋白酶消化八肽后，得到组成为Lys、Ala、Ser及Phe、Lys、Gly的两个三肽及一个二肽，此二肽别CNBr处理游离出Asp。 请写出八肽的顺序及推理过程。,
