1、 微生物学实验报告实验名称：土壤中微生物的分离与纯化 课程名称 环境微生物学实验 学 院 环境科学与工程学院 专业班级 2011 级环境科学（1）班 学 号 3111007364 姓 名 刘迪鸿 联系方式 13824426973 2013 年 12 月 10 日实验报告土壤中微生物的分离与纯化刘迪鸿（广东工业大学 11 级环科（1）班）摘要：各种微生物生长所需条件存在差异，根据需要配制不同的培养基可以得到只含目标菌株的纯培养。关键词：选择培养基，分离，纯化一、 实验目的与要求1. 明确培养基的配制原理，并通过对微生物培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。2. 掌握根据需要选取不同的环境
2、以找到目标菌株的基本方法，学习分离纯化微生物的基本操作技术，进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术，掌握微生物培养方法以及接种方法。二、实验方案1. 实验原理培养基是人工的将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物，因此，培养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源，氮源，能源，无机盐，生长因素。 ）和水，根据微生物的种类和实验目的地不同，培养基也有不同的种类和配置。在土壤，水，空气及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分理它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养
3、的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养，酸碱度，氧等条件的要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离纯化微生物，直至得到纯菌株。2. 实验材料1) 培养基与试剂牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 2.0g，蛋白胨 4.0g，氢氧化钠 2.0g，琼脂 68g，水 400mL。高氏一号培养基配方：可溶性淀粉 4g，硝酸钾 0.4g，磷酸氢二钾 0.2g，硫酸镁 0.2g，氯化钠 0.2g，硫酸亚铁 0.004g，琼脂 68
4、g，水 400mL。马铃薯蔗糖培养基配方：马铃薯 80g，蔗糖 8g，琼脂 68g，水 400mL。马铃薯葡萄糖培养基配方：马铃薯 80g，葡萄糖 8g，琼脂 68g，水400mL。2) 仪器以及其他用品高压灭菌彩。高压灭菌锅，超净工作台，培养皿，移液器，250 毫升锥形瓶 250毫升烧杯。均玻璃珠，接种环，就金丹，显微镜，称量纸等。3. 实验方法1) 实验流程图2) 实验步骤A. 土壤取样广工正门对面山坡，即取即用。B. 培养基的配制培 养 基 类别 培 养 基 配 制 原 料 配 制 方 法 用 于 培 养的 菌 种牛 肉 膏 蛋白 胨 培 养基牛 肉 膏 2.0g， 蛋 白 胨4.0g，
5、 氢 氧 化 钠 2.0g， 琼脂 68g， 水 400mL先 将 牛 肉 膏 、 蛋 白 胨 ， 溶 入 烧 杯 中加 热 搅 拌 至 完 全 溶 解 。 再 加 入 其 他成 分 依 次 溶 解 ， 最 后 加 水 400mL，调 ph7.0-7.2， 加 入 琼 脂 ， 加 热 融化 ， 分 装 ， 121 高 压 灭 菌 20min。细 菌高 氏 一 号培 养 基可 溶 性 淀 粉 4g，KNO30.4g， 磷 酸 氢 二 钾0.2g， 硫 酸 镁 0.2g， 氯 化钠 0.2g， 硫 酸 亚 铁0.004g， 琼 脂 68g， 水400mL先 将 淀 粉 溶 入 烧 杯 中 加 的
6、搅 拌 至 完全 溶 解 ， 再 加 入 其 他 成 分 依 次 溶解 ， 最 后 加 水 至 400mL， 调 ph7.2至7.4， 加 入 琼 脂 ， 加 热 融 化 ， 分装 ， 121 高 压 灭 菌 20min。放 线 菌马 铃 薯 蔗糖 培 养 基 马 铃 薯 80g， 蔗 糖 8g， 琼脂 68g， 水 400mL。 略 霉 菌酵 母 菌马 铃 薯 葡萄 糖 培 养基马 铃 薯 80g， 葡 萄 糖 8g，琼 脂 68g， 水 400mL。 略 霉 菌酵 母 菌C. 灭菌将配制好的培养基，用报纸包扎好的培养皿，用橡胶塞封好的盛有 9mL无菌水的试管，枪头盒装有 45mL蒸馏水与玻
7、璃珠的锥形瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。D. 微生物的分离a) 倒平板 将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号琼脂培养基，马铃薯蔗糖土壤取样 培养基的制备 灭菌 微生物的分离琼脂培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基融化。待冷却至 55至 60时，在高氏一号培养基中加入 1mL的 0.5%重铬酸钾，在马铃薯蔗糖培养基中加入 1mL的 1%的链霉素，然后分别倒平板。b) 制备土壤稀释液 称取土样 5g，放入盛有 45mL 无菌水并带有玻璃珠的烧瓶中。震荡摇晃约二十分钟，使土样与水充分混合，将菌分散，配制成 10-1土壤溶液，用一支 1mL无菌吸管从中吸取 1mL土壤悬液注入盛有无菌水的试管中，吹吸三
8、次，使充分混匀，然后再用一支无菌吸管从此试管中吸取 1mL土壤悬液注入另一盛有 9mL无菌水的试管中，以此类推制成 10-2，10 -3，10 -4,10-5,10-6各种稀释度的土壤溶液。c) 分离微生物操作步骤： 分离细菌i.涂布 将牛肉膏蛋白胨两个平板底面分别用记号笔写上 10-5和 10-6两种稀释度，然后用两支 1mL无菌吸管分别由 10-5和 10-6两管土壤稀释液中各吸取 200uL对号放入已写好稀释度的平板中，加入八个灭菌的玻璃珠轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。ii.培养 倒置于 37温室中培养 12天 分离放线菌i.涂布 将高氏一号两个平板底面分别用记号笔写上 10-3
9、和 10-4两种稀释度，然后用两支 1mL无菌吸管分别由 10-35和 10-4两管土壤稀释液中各吸取 200uL对号放入已写好稀释度的平板中，加入八个灭菌的玻璃珠轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。ii.培养 倒置于 37温室中培养 35天 分离酵母菌与霉菌(如图 1)i.涂布 各取两个葡萄糖与蔗糖平板底面各自用记号笔写上葡 10-4、葡10-5和蔗 10-4和蔗 10-5两种稀释度，然后用 1mL无菌吸管分别由 10-4和 10-5两管土壤稀释液中各吸取 200uL对号放入已写好稀释度的平板中，加入八个灭菌的玻璃珠轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。ii.培养 倒置于 37温室中培养
10、35天E. 挑菌划线分离 使用接种环从待纯化的菌落中蘸取少量菌种，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上面，霉菌和酵母菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基与马铃薯蔗糖琼脂培养基上、放线菌接种在高氏一号培养基上进行划线分离.F. 保存菌种图 1.分离微生物流程示意图三、实验结果在你所实验的四种培养基平板上，长出的菌落分属于那个类群？简述它们的菌落形态特征，并将菌落形态特征填入表 1。答：高氏一号培养基上的菌落分属于放线菌，其菌落形态特征菌落背面有同心圆形纹路，菌落较小。马铃薯葡萄糖培养基和马铃薯蔗糖培养基上的菌落是霉菌和酵母菌，其菌落形态特征：酵母菌：菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。霉菌：菌落大型，
11、肉眼可见许多毛状物。牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落为细菌，其菌落形态为较小的圆形菌落，颗粒状。表 1.菌落特征表大 小 形 态 干 湿 高 度 透 明 度 颜 色 边 缘细 菌 较 小 圆 形 湿 润 粘 稠 易 挑 起 较 透 明 淡 黄 色 光 滑放 线 菌 较 小 颗 粒 状 干 燥 难 挑 起 不 透 明 淡 粉 色 不 光 滑酵 母 菌 较 大 圆 形 湿 润 粘 稠 易 挑 起 不 透 明 白 色 光 滑霉 菌 最 大 网 状 干 燥 易 挑 起 不 透 明 灰 绿 色 不 光 滑特 征 描 写菌 落 类型图 1.纯化的细菌 图 2. 纯化的放线菌图 3. 纯化的酵母菌 图 4. 纯化
12、的霉菌四、问题与讨论1. 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。答：观察菌落形态 一个平板上的单个菌落形态一致，基本可以确定是纯培养。革兰氏染色法测定 使用接种环从该菌落中蘸取少量菌种，然后进行革兰氏染色，显微镜下观察是否为纯菌。划线分离 使用接种环从该菌落中蘸取少量菌种，针对不同的细菌接种在不同的培养基上进行划线分离。如，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上面，霉菌和酵母菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基与马铃薯蔗糖琼脂培养基上、放线菌接种在高氏一号培养基上进行划线分离。然后放在适宜的条件下进行培养，看是否出现杂菌，若没有，则确定为纯培养。2. 如果要分离得到酵母菌，在什么地方取
13、样品为宜？并说明理由。答：酵母是单细胞微生物，它属于高等微生物的真菌类，容易生长，空气中、土壤中、水中、动物体内都存在酵母。有氧气或者无氧气都能生存。要分离得到酵母菌，则应选择酵母菌含量较多而其他菌种较少的样品，虽然酵母菌在自然界分布广泛，但主要还是生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。而腐烂的水果酵母菌的含量是比较多的，因此可以考虑从腐烂的水果中取样，如腐烂的葡萄、苹果。酵母在有氧和无氧环境下都能生存，属于兼性厌氧菌，要获得纯度比较高的酵母，还可以从酒糟里获取。五、心得体会掌握根据需要选取不同的环境以找到目标菌株的基本方法，学习分离纯化微生物的基本操作技术，进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术，掌握
14、微生物培养方法以及接种方法。之前的微生物实验就有配制过培养基，而本次实验，让我对培养基的配制知识有了更大的提升，对培养基的配制原理有了更深的了解。通过对微生物培养基的配制，还让我掌握了配制培养基的一般方法和步骤。本次实验的培养基，其作用是起到选择培养的目的，根据需要选取不同的环境可以帮助我们找到目标菌株。实验过程中，我还学会来分离纯化微生物的基本操作技术，多次使用超净工作台，让我进一步熟练和掌握了微生物无菌操作技术的基本要领。本次实验，对于微生物的培养以及接种方法也让我获益匪浅，相信在以后对微生物的分离与提纯的工作中会有很大的帮助。美中不足的与这次实验由于时间关系，在后续纯化过程中存在不少问题，使得实验结果并不是非常理想。但掌握了方法和原理，这才是最重要的。
