1、1土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较生 命 科 学 与 技 术 学 院 专业 食品科学与工程 学号 2011314003 姓 名 陈莹指 导 教 师 徐 军 韩炎摘要：本实验是微生物学综合性实验项目，包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数（即活菌计数） 、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的培养特征和形态特征、制片染色技术等。 1 本文记录了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。所采每克土样中几种不同类群微生物的含量分别为：细菌/个、放线菌/个、霉菌/个、自生固氮菌/个，说明土壤中微生物种类的繁多和数量的
2、庞大。培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生物。关键词：分离 纯化 平板菌落计数 微生物的形态1.前言：（1） 、微生物在自然界及其在土壤中的分布简况；微生物种类繁多，繁殖迅速，适应环境能力强，因此广泛分布于自然界中，无论是陆地、水体、空气、动植物以及人体的外表面和内部的某些器官，甚至在一些极端环境中都有微生物的存在。 土壤中微生物的数量和种类都很多，包含细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等类群。其中细菌最多，约占土壤微生物总量的 70 90 ，放线菌、真菌次之，藻类和原生动物等较少。土壤微生物通过其代谢活动可改变土壤的理化性质，进行物质转化，因此，土壤微生物是构成土壤肥力的重要因
3、素。 在土壤的不同深度微生物的分布也不相同。其主要原因是由于土壤不同层次中的水分、养料、通气、温度等环境因子的差异，及微生物的特性不同。表面土的微生物数量少，因为这里缺水，受紫外线照射微生物易死亡；在 5 20cm 土壤层中微生物数量最多，若是植物根系附近，微生物数量更多。自 20cm 以下，微生物数量随土层深度增加而减少，至 lm 深处减少约 20 倍，至 2m 深处，因缺乏营养和氧气每克土中仅有几个。 土壤中微生物数量的季节变化是温度、水分、有机残体综合影响的表现。一般，冬季气温低，有些地区土壤几个月呈冰冻状态，微生物数量明显减少。当春季到来，气温回升，随着植物的生长，根系分泌物增加，微生
4、物的数量迅速上升。有的地区，夏季炎热干旱，微生物数量也随之下降，至秋天雨水来临，加上秋收后大量植物残体进入土壤，微生物数量又急剧上升。这样，在一年里土壤中会出现两个微生物数量高峰。 （2） 、土壤中各种类群的微生物的含量的大致情况；土壤微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物 5 大类群。是土壤生物中数量最多的一类。 细菌,每克表层土壤中约含细菌几百万至几千万个，是土壤菌类中数量最多的一个类群;放线菌,每克表层土壤约含放线菌几十万至几千万个，是数量上仅次于细菌的一个类群;真菌,每克表层土壤只含真菌几千至几十万个，是土壤菌类中数量最少的一个类群，但其生物量指每平方米面积中菌体的重量（克） 高
5、于细菌和放线菌;藻类,直径 350 微米,喜湿，多栖居于土壤表面或表土层中，数量较菌类少。土壤中常见的有绿藻、蓝藻和硅藻。蓝藻中有的种类能固定空气中的氮素。 （3） 、土壤中的微生物的作用；土 壤 微 生 物 在 土 壤 中 的 作 用 是 多 方 面 的 ， 主 要 表 现 在 : 作 为 土 壤 的 活 跃 组 成 分 ,土 壤 微 生2物 的 区 系 组 成 、 生 物 量 及 其 生 命 活 动 对 土 壤 的 形 成 和 发 育 有 密 切 关 系 。 同 时 ,土 壤 作 为 微 生物 的 生 态 环 境 ,也 影 响 微 生 物 在 土 壤 中 的 消 长 和 活 性 。 参 与
6、 土 壤 有 机 物 质 的 矿 化 和 腐 殖 质 化过 程 ； 同 时 通 过 同 化 作 用 合 成 多 糖 类 和 其 他 复 杂 有 机 物 质 ， 影 响 土 壤 的 结 构 和 耕 性 。 土 壤 微 生物 的 代 谢 产 物 还 能 促 进 土 壤 中 难 溶 性 物 质 的 溶 解 。 微 生 物 参 与 土 壤 中 各 种 物 质 的 氧 化 还 原 反应 ， 对 营 养 元 素 的 有 效 化 也 有 一 定 作 用 。 参 与 土 壤 中 营 养 元 素 的 循 环 ， 包 括 碳 素 循 环 、 氮素 循 环 和 矿 物 元 素 循 环 ， 促 进 植 物 营 养 元
7、 素 的 有 效 性 。 某 些 微 生 物 有 固 氮 作 用 ， 可 借 助 其体 内 的 固 氮 酶 将 空 气 中 的 游 离 氮 分 子 转 化 为 固 定 态 氮 化 物 。 与 植 物 根 部 营 养 关 系 密 切 。 植物 根 际 微 生 物 以 及 与 植 物 共 生 的 微 生 物 如 根 瘤 菌 、 菌 根 和 真 菌 等 能 为 植 物 直 接 提 供 氮 素 、 磷 素和 其 他 矿 质 元 素 的 营 养 以 及 各 种 有 机 营 养 ， 如 有 机 酸 、 氨 基 酸 、 维 生 素 、 生 长 刺 激 素 等 。 能 为 工 农 业 生 产 和 医 药 卫
8、生 事 业 提 供 有 效 菌 种 ， 培 育 高 效 菌 系 ， 如 已 在 农 业 上 应 用 的 有 根 瘤菌 剂 、 固 氮 菌 剂 和 抗 生 菌 剂 等 。 某 些 抗 生 性 微 生 物 能 防 治 土 传 病 原 菌 对 作 物 的 危 害 。 降 解 土 壤 中 残 留 的 有 机 农 药 、 城 市 污 物 和 工 厂 废 弃 物 等 ， 降 低 残 毒 为 害 。 某 些 微 生 物 可 用于 沼 气 发 酵 ， 提 供 生 物 能 源 、 发 酵 液 和 残 渣 有 机 肥 料 。 （4） 、本实验的主要过程和实验结果，对实验结果的简单说明和分析，通过实验得到的结论等。
9、本实验通过采样、选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数) 、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、等方法，对土壤中的微生物进行分离计数，并通过革兰氏染色等实验观察方法对微生物个体形态等进行培养与观察，以及制片染色技术等。结果发现土壤中微生物的含量极为丰富，含有霉菌，细菌，放线菌菌种。通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。 2.材料与方法2.1 材料2.1.1 土样：以无菌方式采于学校内小园林，置于无菌容器中，待检2.1.2 培养基2.1.2.1 营养琼脂（牛肉膏蛋白胨固体培养基） 1: 牛肉膏 3g/L 蛋白胨 10g/L NaCI5g/L 琼脂 15-20g/L 水 500ml pH 7.0-7
10、.2 121灭菌 20min 2.1.2.2 高氏一号固体培养基 11：可溶性淀粉 20g/L 硝 酸 钾 1g/L 氯 化 钠 0.5g/L磷 酸 氢 二 钾 0.5g/L 硫 酸 镁 0.5g/L 硫 酸 亚 铁 0.01g/L 琼 脂 20g/L 水 500ml pH 7.2-7.4 配置时，先用少量冷水，把 淀 粉 调 成 糊 状 ， 倒 入 煮 沸 的 水 中 ， 在 火 上 加 热 ，边 搅 拌 边 加 入 其 他 成 分 ， 溶 化 后 ， 补 足 水 分 至 500ml ，121灭菌 20min,灭菌后，在 100ml培养基中加入 10%酚溶液 5 滴（作为抑制剂，以抑制细菌的
11、生长） ，制备平板备用。2.1.2.3 查氏固体培养基 1：硝 酸 钠 2g/L磷 酸 氢 二 钾 1g/L硫 酸 镁 (MgSO47H2O)0.5g氯 化 钾 0.5g/L硫 酸 亚 铁 0.01g/L3蔗 糖 30g/L 琼 脂 15-20g/L水 500mL pH 自然 分 装 后 121 灭 菌 20min 2.1.2.4 马丁氏培养基： 1：K H2PO4 1g/L MgSO47H2O 0 5g/L 蛋 白 胨 5g/L 葡 萄 糖 10g/L 琼 脂 1520g/L 蒸 馏 水 500ml pH 自 然1/3000 孟 加 拉 红 水 溶 液 33mg/L 121 灭 菌 30mi
12、n 临 用 前 加 入 0.03%链 霉 素 稀 释 液 100ml,使 每 毫 升 培 养 基 中 含 链 霉 素 30ug 2.1.2.5 无菌水：装有 90ml 蒸馏水和数拾粒玻璃珠的 250ml 锥形瓶一只，装有 9ml 蒸馏水的18180mm 试管数支；121.3， 20 分钟灭菌，备用2.1.3 染色液2.1.3.1 革兰氏染色液 1 草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液等2.1.3.2 0.1%美蓝 1 用于放线菌菌丝形态观察2.1.3.3 乳酸石炭酸棉蓝液 1 A 液：碱性复红(basic fuchsin) 03g95%酒精 10mlB 液：石炭酸 50g蒸馏水
13、 95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入 95%酒精，继续研磨使其溶解，配成 A 液。将石炭酸溶解于水中，配成 B 液。混合 A 液及 B 液即成。通常可将此混合液稀释 510 倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。用于霉菌形态观察2.2 方法2.2.1 制备土壤稀释液 称取土样 10g，放入盛 90mL 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。静置，成为土壤悬液(10-1)。用 1mL 的无菌吸头从中吸取1mL 土壤悬液注入盛有 9mL 无菌水的试管中，吹吸 3 次，振荡混匀 (10-2)。然后再用同一支 1mL吸头，从此管中吸取 1mL 注入另一盛有 9m
14、L 无菌水的试管中(10-3)，依此类推制成 10-4，10-5，10-6，10-6 各种稀释度的土壤溶液。42.2.2 制备及涂布平板 用一支 1mlL 无菌吸管分别从稀释度 10-7、10-6 和 10-5 的土壤稀释液中各吸取 0.2mL 菌液于已备好的 2.1.2.1 平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做 1 个平板。 用一支 1mlL 无菌吸管分别从稀释度 10-6、10-5 和 10-4 的土壤稀释液中各吸取 0.2mL 菌液于已备好的 2.1.2.2 平板，用无菌玻璃涂
15、棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做 1 个平板。 用一支 1mlL 无菌吸管分别从稀释度 10-5、10-4 和 10-3 的土壤稀释液中各吸取 0.2mL 菌液于已备好的 2.1.2.3 平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做 1 个平板。 用一支 1mlL 无菌吸管分别从稀释度 10-5、10-4 和 10-3 的土壤稀释液中各吸取 0.2mL 菌液于已备好的 2.1.2.1 平板，用无
16、菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做 1 个平板。 2.2.3 培养培养基 2.1.2.1 平板倒置于 37培养箱，23 天；培养基 2.1.2.2 平板倒置于 28培养箱 57 天；培养基 2.1.2.3 和培养基 2.1.2.4 平板倒置于 28培养箱 35 天；2.2.4 菌落计数 培养结束后，根据不同类群的微生物的菌落特征，分别在不同的培养基平板上统计相关类群的微生物菌落，即培养基 2.1.2.1 统计细菌的菌落；培养基 2.1.2.2 统计放线菌的菌落；培养基 2.1.2.3 和培养
17、基 2.1.2.4 统计霉菌的菌落。由下式计算每克土壤中相关微生物的菌落形成单位（cfu）： 个/克=同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数52.2.5 挑单菌落 从不同的培养基平板上，选取细菌、放线菌和霉菌各三个菌落分别转接到营养琼脂、高氏一号、查氏培养基斜面中，每个菌落接两支斜面试管，编号标记，分别置培养箱培养，备用2.2.6 细菌的革兰氏染色和形态观察 对从 2.2.5 中选出的细菌分别做革兰氏染色，观察记录三株细菌的革兰氏染色结果和个体形态2.2.7 放线菌的插片培养和形态观察 对从 2.2.5 中选出的放线菌分别做平板划线、插片培养，培养后观察记录三种放线菌的菌丝形态。每个平板中，以
18、约 45角将 1-2 片无菌盖玻片斜插入平板上第一次划线的部位。2.2.8 霉菌的点植培养和形态观察 对从 2.2.5 中选出的霉菌分别做点植培养，每个平板上点植接种三个点，培养后制片，观 察 、 记 录 三种霉菌的菌丝和产无性孢子的子实体的形态3.结果3.1 土壤样品中细菌、放线菌、霉菌的菌落形成单位（cfu）见表 1、表 2、表 3： 表 1 细菌稀释度 10-5 10-6 10-71 8 2 32 16 12 1各重复的 菌落数3 21 39 315cfu/克 4.22*106 2.93*107 1.62*108平均（cfu/ 克） 6.52*107表 2表 3放线菌稀释度 10-4 1
19、0-5 10-61 36 0 02 12 9 0各重复的 菌落数3 5 4 6cfu/克 1.38*105 2.83*105 1.5*106平均（cfu/ 克） 6.40*105霉菌稀释度 10-3 10-4 10-5培养基 2.1.2.3 2.1.2.4 2.1.2.3 2.1.2.4 2.1.2.3 2.1.2.41 3 80 2 7 0 12 8 65 1 3 0 8各重复的 菌落数3 9 55 2 10 0 0cfu/克 0 6.33*104 1.33*104 105 1.5*105 2*10563.1.1 细 菌 是 ， 形 成 的 菌 落 小 ； 细 菌 个 体 之 间 充 满 着
20、 水 分 ， 整 个 菌 落 显 得 湿 润 ， 易 被 接 种 环 挑起 ； 球 菌 形 成 隆 起 的 菌 落 ； 有 鞭 毛 细 菌 常 形 成 边 缘 不 规 则 的 菌 落 ； 具 有 荚 膜 的 菌 落 表 面 较 透 明 ，边 缘 光 滑 整 齐 ； 有 芽 孢 的 菌 落 表 面 干 燥 皱 褶 ； 有 些 能 产 生 色 素 的 细 菌 菌 落 还 显 出 鲜 艳 的 颜 色 。3.1.2 放线菌菌落特征：菌落干燥、不透明，表面呈致密的丝绒状，其上有一层彩色，主要为粉红色的“干粉 ”，菌落和培养基连接紧密，难以挑取，其正反面颜色不一致。正面为粉红色，而反面为乳白色，在菌落边缘
21、的琼脂平面有变形现象。73.1.3 曲霉菌落特征：菌落较大，质地疏松，外观干燥而不透明，菌落与培养基连接紧密，不易挑取，其正反面颜色不同，边缘不整齐，其正面为淡黄色，反面为黄色。高度较高，隆起。3.1.4 根霉菌落特征：菌落无定形，为絮状，高度很高，覆盖整个培养皿，质地疏松，外观干燥为褐色、不透明。菌落与培养基连接紧密，不易挑取。3.2 分离的三株细菌的革兰氏染色结果及形态见表 4：3.3 分离的放线菌的形态见图 1：3.4 分离的霉菌的形态见图 2：表 4子囊孢子菌株编号 革兰氏染色结果 菌体形态1 G- 球菌2 G- 杆菌3 G+ 球菌8气生菌丝基内菌丝9C-4-f-02 放线菌的形态特征
22、图 1C-5-m-1 C-4-m-0110图 24.讨论4.1 结果 3.1 说明土壤中分布着种类繁多和数量巨大的微生物。没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。自然界中，在大多数场合微生物群落是由多种微生物组成的，从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其
23、当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释法几乎是不可能的。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离 4.2 结果 3.2 培养基中的某些组分对富集、分离和纯化特定的微生物有较重要的作用4.3 实验的结论性的小结微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞
24、。计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个菌 )，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。在实验中通过配置不同浓度的培养基，用于所采集土壤样品中微生物的接种，经过培养后，进一步使用选择培养基对培养菌种进行培养，以达到分离各种微生物的目的。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。进行分离时常用的方法有：1). 简易单细胞挑取法;2). 平板分离法。本实验
25、采用的是平板分离法，其是普遍用于微生物的分离与纯化的方法。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。在进行纯化及培养后，对其所形成的菌落形态进行观察，发现许多菌落呈现的颜色、形态、透明程度，均有所不同，从而进一步进行革兰氏染色后观察，确定微生物的种类，可见培养菌种11既有阴性又有阳性，从菌落计书数的结果来看，每种平板中的菌落数值均较大，由此可见土壤中微生物种类繁多。 4.4 你在实验中的成功和不足之处。实验中的收获、经验等4.4.1 为保证实验成功，必须做到以
26、下几点第一，为保证接种的成功，所用仪器必须彻底灭菌，接种时必须在无菌条件(即酒精灯火焰旁)下进行操作，以防止所接菌种被杂菌污染；第二，需注意实验设计的基本准则：重复、随机、对照;第三，在接种操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。 4.4.2 不足由于经验不足以及一些无菌操作的不熟练，使培养基有一定的杂菌污染，导致实验数据出现一定的误差。4.4.3 收获通过本实验，学习、掌握微生物的鉴定方法，对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定，通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。通过实践，巩固了理论知识，为以后的学习打下了坚实的基础。参考文献1 沈 苹 范绣容；微生物学实验 （第 4 版） 北京 高等教育出版社 2007.2 周德庆微生物学教程 （第三版） 北京高等教育出版社 2011.
