第五章分子生物学技术上.ppt

1、第五章 分子生物学基本研究法（上） DNA、RNA及蛋白质操作技术,阮华 ,扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你 的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。,基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转 化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点 突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。,基因工程技术是

2、核酸操作技术的一部分，只不过它强 调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍 与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因 置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术 区别于其它生命科学技术的根本特征。,重组DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因 的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质 基础问题。二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留 复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和 操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息 的流动与表达机制。,重组

3、DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因 的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质 基础问题。二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留 复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和 操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息 的流动与表达机制。,半保留复制 复制的半不连续性,半保留复制动画,重组DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因 的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质 基础问题。二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构

4、模型和半保留 复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和 操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息 的流动与表达机制。,Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。,中心法则动画,5.1 基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有5粘性末端的小片段。,目前NEB公司售卖234种ResRE 随机切割DNA分子（假定4种碱基在DN

5、A中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096bpDNA有一个酶切位点，而一个4碱基切割酶平均每256bpDNA就有一个酶切位点。,图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。,Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs.,重组DNA实验中常见的主要工具酶,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主

6、复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。,具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。,（二）基因克隆的载体一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性： （1）分子量小、具有自我复制能力； （2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点； （3）能插入较大的外源DNA片段； （4）具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。 （5）对宿主细胞无害。,大肠杆

7、菌质粒载体:1、pSC101质粒载体第一个真核基因克隆载体。长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。缺点：它是一种严紧型复制控制 的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞 仅有12个拷贝，从带有该质粒的 寄主细胞中提取pSC101DNA，产量 很低。,2、ColE1质粒载体质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 严紧控制型(Stringent control)只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复

8、制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。 松弛控制型(Relaxed control)在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20 个以上,如 Col E1质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制均受到抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒DNA继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总DNA的50%左右。,3、pBR322质粒载体 由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）第二部

9、分来源于pSC101 质粒的四环素抗性基因（tetr）第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。,优点： 具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。 有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。 有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积10003000个拷贝，便于制备重组体DNA。,4、pUC质粒载体： 来自pBR322质粒的复制起点（ori）以及氨苄青霉素抗性基因（ampr） 大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）启动子及编码-肽链的DNA序列。特称为lacZ基因 LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸

10、的-肽，IPTG（异丙基- -D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的-半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。 位于lacZ基因5-端的一段多克隆位点（MCS） 外源基因插入破坏lacZ基因功能，含X-gal培养基中非重组DNA分子转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。,1.更小的分子量和更高的拷贝数 在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点， 其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。

11、由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时， 平均每个细胞即可达500700个拷贝。2.具有多克隆位点MCS区段 可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。3.易于重组体转化子的筛选 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。含X-gal培养基中非重组体转化子转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。,优点：,5、pGEM-3Z质粒：长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。含有两个噬菌体启动子(T7

12、和SP6)，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。,6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增，用途广泛。,7、pBluescript噬菌粒载体：pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体， 简称为pBS （ +/- ）， 如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。

13、, SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录； （+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。 f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。,1.在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；2.具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBlues

14、cript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；4.含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。,特点：,图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。,具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以

15、作为基因导入的载体。,获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。,图5-3 重组DNA操作过程示意图,Plasmid_Cloning动画,5. 2 DNA操作技术5. 2. 1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（ agarose ） 和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳

16、分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以， DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片

17、段的能力,由于插入了溴化乙锭分子，在紫 外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。缺点：高诱变性。,图5-4 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。,高灵敏度: GelRed 和 GelGreen 是目前市场中最灵敏的凝胶核酸染料; 稳定性极好: 可以使用微波炉加热，可以在室温下保存 更安全: 艾姆斯氏试验结果表明，该染料的诱变性远小于溴化乙锭 （ EB ）; 适应广泛: 适用于预制凝胶和凝胶电泳后染色； 缺点：费用高。,图. 在 1 TBE 中分别用 GelRed 和 EB 预制 1% 琼脂糖凝胶中 1Kb Plus DNA Ladder 稀释物的电泳

18、图。从左至右各泳道 DNA 总量分别为 : 200 ng ， 100 ng ， 50 ng and 25 ng 。凝胶用 300nm 透视器显像，用 EB 滤光片和 Polaroid 667 黑白胶片拍照。,Adopt from Biotium website,GelRedTM and GelGreenTM 灵敏、稳定、安全的核酸凝胶染色剂,图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图,50kb DNA 分子的凝胶电泳,5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来

19、，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。,CaCl2法将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到51062107个转化子/g超螺旋质粒DNA。,图

20、5-5 细菌转化及蓝白斑筛选,2. 电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10% 的甘油悬浮， 将高密度菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为4.55.5毫秒。电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,凯利穆利斯（Kary Mullis），1944 年生于美国。乔治亚理

21、工科大学毕业后，在加利福尼亚大学伯克利分校获得博士学位。 1979 年任塞托斯公司的研究员。 1988 年，穆利斯使用来源于水生栖热菌（ Thermus aquaticus ）的耐热 DNA 聚合酶，建立了聚合酶链式反应技术（ PCR ）。1989年12月， 著名的自然科学杂志“SCIENCE”将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。PCR 技术是生命科学领域中的一项革命性创举和里程碑。由此穆利斯在 1993 年获得诺贝尔化学奖。,5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术,PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA

22、为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的DNA互补链。PCR反应体系：反应溶液(Mg2+)，模板，引物，四种脱氧核苷三磷酸， DNA聚合酶。,DNA解链（变性） 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。 引物与模板DNA相结合（退火） 降低反应温度（退火，约50），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 DNA合成（链的延伸） 将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子

23、按53方向延伸，合成新生DNA互补链。,聚合酶链式反应（PCR）示意图,经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n.,图5-7 聚合酶链式反应（PCR）技术,图5-8 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较,PCR动画,PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。,两步法RT-PCR示意图,1.RT-PCR,常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序

24、列，这就需要应用反向PCR（reverse PCR or inverse PCR）技术。 用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA； 产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过23kb，经连接后重新环化； 按靶序列设计的一对反向的引物与互补序列退火结合，进行PCR扩增。,2. 反向PCR(reverse PCR or inverse PCR),波纹线表示靶DNA区段， 箭头表示限制性内切酶位点， 黑白方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。,反向PCR的基本操作程序,又称巢式PCR，是一种染色体步移技术（Genome Walking）。与反向PCR一

25、样用于扩增已知DNA区段外的侧翼序列。一般用于转基因生物插入位点的鉴定。,3.热不对称交错式PCR （TAIL-PCR，Thermal Asymmetric Inter-Laced Polymerase Chain Reaction）,TAIL-PCR原理： 该技术通过3个嵌套的长特异性引物（sp）分别和短的随机简并引物（AD）组合进行连续的PCR循环。由于两个引物长度不同因而退火温度也不相同的，高退火温度的PCR循环有利于由长引物引起的DNA扩增，低温循环时两个引物的扩增效率基本相同，可以利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。,or,第一轮反应（

26、Primary reaction）是TAIL-PCR的重要环节，先进行5轮高严谨性循环，特异性引物与模板退火，只能发生单引物循环，sp1上游侧翼序列得到线性扩增。大幅度降低退火温度，使AD及sp1均与模板DNA相结合，指数扩增一个循环。此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，共15个循环。特异性序列（两端分别拥有sp1和AD序列）和非特异性序列I（只有sp1，没有AD序列）大大超过非特异性序列II （两端均为AD序列）。第二轮反应，特异性序列再次被优先扩增，经稀释的非特异性序列I也已大为降低，此时已没有明显的背景片段了。第三轮反应是真正意义上的PCR，共20个循环，进一步扩增特异性序列。,运

27、用Ac/Ds系统进行斑马鱼基因捕获筛选,Tail-PCR鉴定斑马鱼中Ds插入位点,在已知cDNA序列基础上克隆5或3端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE，用于扩增3端的称为3RACE。,4. RACE技术（rapid amplification of cDNA ends）,1.在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（GSP1）启始cDNA第一条链合成。2.RNase降解模板链mRNA，纯化第一链。3.用末端转移酶在cDNA链3端加入连续的dATP。4.以连有oligo(dT) 的锚定引物和基因片

28、段内部特异的nested引物进行PCR扩增，得到目的片段，随后测序可得到5缺失序列。,5 RACE,1,2,3,1,2,3,5RACE鉴定Ac/Ds在斑马鱼中捕获的基因,1. Danio rerio zgc:153383 (zgc:153383), linkage group 20 2. Danio rerio topoisomerase (DNA) I, like (top1l), linkage group 11,3 RACE,1、用oligo(dT)锚定引物启始cDNA第一链的合成。2、降解模板mRNA。3、用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3片段，随后测序可得到

29、3缺失序列。,由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。,5. 实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）,原理：混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。,SYBR Green I作探针的实时定量PCR实验过程,非序列特异性荧光染料SYBR Green I （激发光波长520nm

30、）在PCR反应体系中仅能与双链DNA结合后，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映PCR产物的产量。缺点：检测PCR反应中的全部双链DNA，不能区分不同的双链DNA。,TaqMan 探针实时定量PCR 技术,为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。随着PCR反应的进行，TaqMan 探针结合到目的DNA序列上， 并且会被具有外切酶活性的Taq

31、DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。,Realtime PCR 动画,图5-11用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。,* Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。,Han P., Li Q., and Zhu Y.X. (2008) The PlantCell 20:1482-1493.,图5-12实时定量PCR法对不同样品中的目的cDNA含量的相对定量。,野生型拟南芥WT与抑癌基因失活的拟南芥突变体

32、bard1-3中WUS基因的表达丰度比较,5. 测序（sequencing）,Maxam-Gilbert的化学修饰法2. Sanger的双脱氧链终止法利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列 DNA聚合酶以单链DNA为模板，用一种引物合成准确的互补序列。 在反应混合物中参入双脱氧核苷酸，会导致DNA链的延伸终止。,sequencing 动画,ABI DNA自动测序仪3730XL,把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 基因组文库必须

33、具有一定的随机性和代表性。,5. 2. 4 基因组DNA文库构建,构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克隆能力约1520kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4 个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A， 与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的噬菌体载体上。,图5-13 用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。,此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。它们的优点是可以插入更大片段

34、DNA（701000kb），但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。,5. 3 RNA基本操作技术,细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：80%-85%为rRNA rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA 的1%-5%,Trizol（异硫氰酸胍-苯酚）抽提法硅胶膜纯化法,5. 3.1 total RNA的提取,RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD2

35、60和OD280来判断。 OD260为1时相当于浓度为40g/ml ， 而OD260 / OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。*RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD230， OD260和OD280来判断。 OD260 / OD280的比值如果在2.0，提示所提取的RNA质量好， 2.1，提示所提取的RNA有降解的可能； OD260 / OD230的比值如果在2.0，提示所提取的RNA纯度好， 3，提示所提取的RNA有异硫氰酸胍的污染.,0.4 ug human total RNA,图

36、5-14 PolyA Tract mRNA的分离纯化过程简图。（Promega 公司）,5. 3.2 mRNA的纯化,图5-15 cDNA合成过程示意图。,5. 3.3 cDNA的合成,由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我复制的载体中。,图5-16 定向cDNA 合成及分子修饰,cDNA两端加上不同的酶切位点，可以保证所获得的双链cDNA的方向性。反应体系中加入甲基化dCTP,可以保证新合成的cDNA链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶

37、切割。因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。,真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。,5. 3.4 cDNA文库的构建,cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用Uni-zap XR（一种噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript载体的全

38、部序列。重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。,基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。,5. 3.5 基因文库的筛选,图5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图,5.3.5.1 核酸杂交法,核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。,将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长

39、有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。,将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因引物对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。,5.3.5.2 PCR筛选法,该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该

40、基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。,5.3.5.2 免疫筛选法,图5-18 噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图,在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。在细胞水平上， 克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,5. 4 基因克隆（clone）技术,在没有任何探针的情况下，用于克

41、隆控制某一特定性状或者生理反应中间步骤的基因。通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。 因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。 经过23次的重复后，T群体中的非特异性序列几乎被清除。每次T减D反应后仅设置72复性与延伸，94变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得cDNA片段的纯度高。,5. 4. 1 cDNA差示分析法(RDA,Representation Difference Analysis),图5-23 RDA流程图,Gateway技

42、术利用噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。,5. 4. 2 Gateway大规模克隆技术,1.TOPO反应 将目的基因PCR产物连入Entry载体。载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过274位酪氨酸与切口处的磷酸基团形成共价键， 将该酶偶联在载体上。5GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。2.LR反应 将目的片段从Entry 载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的

43、作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。,图5-24 Gateway 大规模克隆策略,又称定位克隆(positional cloning)。 1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出,所有具有某种表现型的未知基因都可以通过该方法克隆得到。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，必须具备以下两方面的基本情况:一）是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、DH、BC、RI 等。二）是开展以下几项工作: 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记; 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置; 构建含有大

44、插入片段的基因组文库(BAC 库或YAC); 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库; 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群; 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆; 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆; 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。,5. 4. 3 基因的图位克隆法（Map-based cloning）,遗传标记（Genetic marker）指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。四种类型： 1.形态标记（morphological marker）即植物的外部形态特征。 2.细胞学标记(cytolo

45、gical marker)即植物细胞染色体的变异。 3.生化标记(biochemical marker)主要包括同工酶和等位酶标记。 4.分子标记(molecular marker) 指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记，如限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； 第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记，包括随机扩增多态性DNA标记（Rando

46、m amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）、简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）、序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）、序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等

47、； 第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）、表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。,1 RFLP标记该技术由Grodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限

48、制性等位片段的变化，从而产生RFLP。该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。,在RFLP作图中，连锁距

49、离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM1000kb；拟南芥菜中，1cM290kb；小麦中，1cM3500kb。,2 RAPD 由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。 RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。RAPD标记的主要特点有：（1

50、）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。,3.SSR（SSLP） 由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如(CA)n、(AT)n、(GGC)n等重复。不同遗传材料中，这种基序重复次数的可变性导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSLP标记。SSR(SSLP)标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,