1、525 基因组DNA文库构建,基因组文库(Genome library) cDNA文库(cDNA library),基因组文库（Genome Library）,把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定。,基因组文库大小的计算:Clark和Carbon于1975年提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（
2、 N ）的公式,N= ln (1-p )/ ln (1-f ) N代表一个基因组文库所应该包含的克隆数目p 代表所期望的靶基因在文库中出现的概 率，即筛选到目的基因的可能性，通常设定为 0.95或0.99f 代表克隆中插入片断的平均长度和基因组DNA总长的比值。 f=a/b; a代表载体中插入片段的平均大小，b 代表基因组大小,噬菌体载体和粘粒载体是早期构建真核细胞基因组文库的最常用的两类载体。噬菌体载体可容纳20kb的插入片段，粘粒载体可容纳45kb的插入片段。 如果P设为0.95，假设一个物种基因组大小为8.6x108bp，噬菌体载体构建基因组文库时所需克隆数目130000个，粘粒载体57
3、000个克隆。,基因组DNA文库存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G文库。,用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。,YAC (Yeast artificial chromosome) 、 BAC (Bacterial artificial chromosome) 及 PAC(P1 - derived artificial chromosome) 等人工染色体载体, 100-3000kb,cDNA文库的构建,主要原因： （1）真核生物基因组十分庞大（104-107kb） ，其复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左
4、右，直接从基因文库中分离目的基因比较困难； （2）真核基因组含有大量的重复序列，单拷贝基因只占染色体DNA的一小部分（10-5-10-7 ）； （3）真核基因内一般都含有间隔序列（内含子），这就限制了其在E.coli中的表达。,分离真核生物基因一般构建cDNA文库,这个问题可以通过由mRNA产生的cDNA克隆而得以部分解决。 cDNA是指以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA （complementary DNA，cDNA） 。,cDNA的合成 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反
5、转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。,cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。实际为不包含内含子的基因组文库。,cDNA文库(cDNA library),cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c文库。,5.3 RNA基本操作技术,5.3.1 总RNA的提取 5.3.
6、2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 5.3.5 基因文库的筛选,5.3.1 总RNA的提取,RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法,TriZol试剂. 异硫氰酸胍-苯酚法 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来的同时也使RNA酶失活。,TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RN
7、A与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。 水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，总RNA提取电泳后3条特征性条带：28S、18S、5S是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数 。特别是28S和18S特征性条带。,2. mRNA的纯化 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。 利用mRNA的PolyA结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与Poly A杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体
8、，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。,2、高质量mRNA的制备,用试剂盒（Invitrogen）提取总RNA,加入与生物素相连的寡聚(dT)引物与总RNA温育,加入与微磁球相连的抗生物素蛋白,通过磁场吸附作用吸附与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA，从总RNA中分离,洗脱得到mRNA,3、反转录生成cDNA,以寡聚dT或随机6核苷酸为引物,反转录酶,cDNA第一链,以cDNA第一链为模板合成cDNA第二
9、链,加接头，准备与载体连接,为了得到有方向性的cDNA应该接上不同的接头,加入带有酶切位点的寡聚dT引物,高活性的反转录酶,合成cDNA的第一链,合成cDNA第二链,用RNase H分解RNA链,加Eco RI接头,用Xho I内切酶切割,得到双接头有方向性的cDNA,(5CTCGAG),(5GAATTC),Xho I,4、与噬菌体载体分子相连接,带有接头的cDNA,噬菌粒DNA经内切酶切割,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA,5、噬菌粒的包装,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA,体外蛋白质外壳的包装反应,有侵染和复制能力的成熟噬菌体,进行基因组学的研究,含有某种组织或器官的噬菌粒文库
10、,高质量mRNA的制备,反转录生成cDNA,与噬菌粒载体分子相连接,噬菌粒的包装,cDNA噬菌粒文库的主要步骤：,5.3.5 基因文库的筛选,1.核酸杂交法 2.PCR筛选法 3.免疫筛选法,基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有：,1、核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。,图 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图,2、PCR筛选法 将整
11、个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。,3、免疫筛选法 该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。,图5-18 噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图,定义：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同序列长度里的单个碱基的差别。1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性
12、 标记（single nucleotid polymorphism SNP） 制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,5. 4 单核苷酸多态性 （single nucleotid polymorphism，SNP）,DNA的多态性,DNA的多态性：在长期的进化和适应环境的过程中在正常群体中，由于各个体DNA分子的某些位点发生中性突变 ，产生基因序列差异的现象被称为基因（或DNA）多态性。,单核苷酸多态性（SNPs）的发生频率最高，人类DNA中每300-1000个碱基对就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。,不同个体的DNA序列上的单个碱基的差异被称作单核苷酸多态性
13、（SNPs）。 同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点allele 一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型（genotype）。检定一个人的基因型，被称作基因分型（genotyping）。 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型（haplotype）。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。,区分几个概念,通过对图中的三个标签SNPs进行基因分型，研究者可以确定每个个体拥有图示的四个单体型中的哪一个。,国际人类基因组单体型图计划：HapMap计划,HapMap计划将鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异识别这些单体型的标签SNPs。 200
14、2年10月，中国、美国、英国、日本、加拿大五国代表在美国华盛顿正式启动了这项计划。中国完成10，美国完成31，日本占25，英国占24，加拿大占10。 中国负责3号、21号和8号染色体单体型图的绘制。 通过单体型图计划将鉴定出20 100 万个标签SNP 位点。,3 SNP的应用,人类基因但体型图的绘制 与疾病易感基因的相关性分析 指导用药与药物设计,检测方法,比较新兴的方法包括： Taqman探针技术、 磷酸测序(pyrosequencing)、 DNA芯片(DNA chip)分析、 变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatogra
15、phy,DHPLC)、 能量转移标记的等位特异PCR、 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)等.,SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（RFLP）和微卫星标记（SSR）之后的第三代遗传标记。,分子标记的概念,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列和蛋白质。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DN
16、A片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,分子标记的种类,分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括： 限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； 原位杂交（in situ hybridization）等；,第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplificatio
17、n polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； 简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； 序列标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； 序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；,第三类是一些新
18、型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。,Contents,1、重组DNA技术 2、DNA基本操作技术 3、RNA基本操作技术 4、SNP的理论与应用 5、基因克隆技术 6、蛋白质组与蛋白质组学技术,生命科学各个研究领域中，“克隆”（clone) 被广泛使用。通常克隆是无性繁殖。有不同层面的含义： 在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体；从同一受精卵分裂而来的单卵双生子属于同一克隆
19、。 在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子生物学上，将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,55 基因克隆技术简介,551 RACE技术 552 应用cDNA差示分析法克隆基因 554 基因的图位克隆法,551 RACE技术,RACE技术（rapid amplification of cDNA ends）在已知cDNA序列基础上克隆5或3端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE，用于扩增3端的称为3RACE。,使用此
20、方法的要求是必须知道一段核苷酸序列信息，以此来设计5末端和3末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs） 根据已有的基因序列设计5和3RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。,552 应用cDNA差示分析法克隆基因,cDNA差示分析法 (Representational difference analysis，RDA) 1994 年Hubank和Schatz 建立了cDNA RDA 方法, 可以筛选mRNA 的差异表达,克隆差别表达的基因。,此方法充分利用了PCR反应中双引物以指数形式扩增双链模板、而单引物仅以线性形式扩增单链模板这一特性
21、，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异性地扩增目的基因片段。如今cDNA RAD技术，已被广泛地应用于分离编码产物未知的基因。,技术原理将试验对象(Tester) （T）和供试探针(Driver) （D）在接受差别分析前，分别用同一种识别4碱基序列的限制性内切酶切割，形成的平均长度为256bp的cDNA片段代表群，保证了绝大多数遗传信息均能被扩增；T与D反应后仅设置了72复性与延伸和95变性两个参数，共20个循环，从而使PCR产物的特异性及所得的探针的纯度均大为提高。,试验对象 （Tester）,供试探针 （Driver）,4碱基切割酶处理,平均长度256bp的代
22、表群,cDNA,cDNA,加12/24碱基接头,补平末端,以接头为引物进行PCR扩增，分离纯化；将接头切除，,T改换新接头,D不加接头,杂交：T:D=1:100,以新接头为引物进行扩增,指数扩增产物差异产物,变性、退火,朱玉贤等 (1997) 用cDNA差式分析法克隆受赤霉素GA抑制的豌豆基因。,由于长短日照条件下生长的豌豆细胞中绝大部分mRNA相同，短日照豌豆样品中绝大部分cDNA将与长日照豌豆样品中的cDNA形成杂合双链。,短日照特异性表达基因（控制G2豌豆短日不衰老基因）无法在长日照样品中找到互补cDNA链，无法形成杂合双链，只能形成两条链上都有与引物相匹配的接头序列的纯合双链，按指数形
23、式扩增，经过20-25个循环后被富集数百万至上千万倍。,5.5.4基因的图位克隆,图位克隆法(map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)是分离未知性状目的基因的一种好方法。理论上讲，所有具有某种表型的基因都可以通过该方法克隆得到。图位克隆在理论上适用于任何物种，但目前主要还是用于真核生物。 1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，,实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂
24、交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。,图5-26 染色体步移法克隆基因示意图,用图位克隆法获得水稻脆杆基因BCl,将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间； B. 覆盖BCl位点的BAC大片段。 C. BCl位点的精细定位。BCl位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。 D. BCl基因结构。红色为编码区，白色为5和3非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。,5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术,蛋白质组学是蛋白质（prot
25、ein）和基因组（genome）研究在形式和内容两方面的组合，该技术致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。,蛋白质组（Proteome）这一概念是由澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公开发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上。 其英文PROTEOME是由PROTEins和genOME两个词组合而成，意思是“proteins expressed by a genome” 。,蛋白质组学研究主要涉及两方面的内容： 一是表达蛋白质组学，即蛋白质组表达模式的研究； 二是细胞图型蛋白质组学，即蛋白质
26、组功能模式的研究。 其研究的主要支撑技术有 双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)、 质谱(mass spectrometry，MS)为代表的蛋白质鉴定技术、 基因组学和生物信息学。,5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术,5.6.1双向电泳技术 5.6.2质谱(mass spectrometry，MS) 5.6.3蛋白质免疫印迹实验,561 双向电泳技术,双向电泳（two dimension electrophoresis，2D）是分离混合蛋白质最常用的方法。 由OFarrell等于1975年创立 该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分
27、子质量的不同而构建的。,双向电泳由两部分构成：等电聚焦（IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。 原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳和 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离。是蛋白质组学研究的核心技术之一。,1、等电聚焦电泳,2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,双向电泳,蛋白质被分离以后用考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或放射性标记等方法显示。其中银染方法非常灵敏，蛋白质分辨率可以达ng级。,野生型和突变体棉花胚珠总蛋白质样品的双向电泳图谱比较,2-DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率，便于计算机进行
28、图像分析处理，可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，已成为蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。,562 质谱(mass spectrometry，MS),质谱技术是蛋白质组研究中的重要鉴定技术，是一种超灵敏的鉴定技术。,进样系统,离子源,质量分析器,检测器,1.气体扩散 2.直接进样 3.气相色谱,1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光,1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间 4.四极杆,质谱仪需要在高真空下工作：离子源（10-3 10 -5 Pa ）质量分析器（10 -6 Pa ）,质谱分析原理,其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场
29、将具有特定质量与电荷比值(/值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的/值，分析鉴定未知蛋白质。,在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行； 改变加速电压V, 可以使不同m/e 的离子进入检测器。 质谱分辨率 = M / M （分辨率与选定分子质量有关）,质量分析器原理,目前常用的质谱包括两种： 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和 电喷雾质谱（ESI-MS）。,LDI-1700激光解吸飞行时间质谱仪,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,MALDI-TOF-MS的基本原理是将微量蛋白质与过量小分子基质分子(主要是有机酸
30、)的混合液体点到样品靶上, 经加热或风干形成共结晶, 然后放入离子源内，用激光(337 nm的氮激光)照射靶点上的晶体时,晶体升华, 导致蛋白质的电离和汽化并进入气相。,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,飞行时间（time of flight，TOF）质量分析器 TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道, 根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比 , 来检测离子。理论上, 只要飞行管有足够的长度, TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。,图5-31 MALDITOF分子质谱仪原理图,电喷雾质谱（ESI-MS
31、）,1989年, Fenn J B等首次 使用。于2003年获得诺贝尔化学奖。 ESI-MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器 。,联用技术,可以将联用技术理解为将两种或两种以上的分析技术连接起来以便得到一种更快、更有效的分析工具。 两种光谱技术的联用（例如MS和MS） 两种色谱技术的联用（例如LC和GC） 分离技术和光谱技术的联用（例如GC和MS）更好地体现了联用技术的优点,质谱联用技术,气相色谱-质谱联用技术 GC
32、/MS 液相色谱-质谱联用技术 LC/MS 电感耦合等离子体-质谱法 ICP/MS 毛细管电泳-质谱法 CE/MS,气相色谱/质谱联用技术 GC/MS仪器图,仪器内部结构,质谱联用仪器,563 蛋白质免疫印迹实验,免疫印迹(immunoblotting)或蛋白质印迹(Western blotting) 是20世纪70年代末80年代初在蛋白质凝胶电泳与固相免疫测定结合基础上发展起来的蛋白质检测技术。是检测目标蛋白质的一项十分有效、常用的方法。,Western Blotting,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Sout
33、hern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,免 疫 印 迹 法 示 意 图,蛋白质印迹流程： 蛋白质样品制备 SDS-PAGE分离样品 转膜 固定在膜上蛋白质作为抗原，抗原抗体（一抗）结合 加入酶偶联或放射性同位素标记二抗，显色或放射自显影检测蛋白质。,常用的二级抗体：,1.放射性标记的抗体
34、 最早使用，定量最准确的方法。已逐渐被非放射性检测系统取代。2.与酶偶联的抗体 酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP) 。 显色：辣根过氧化物酶：底物为DAB；呈棕黄色 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT; AP最敏感的底物，呈紫色,3与生物素偶联的抗体 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名维生素H。 MW 244.31kD 能与抗生素蛋白高亲和结合。生物素经恬化后易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。 生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）已在整个生物学领域中得到广泛应用,蛋白质样品,电泳,非标记抗体（一抗）发生免疫反应,荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应,通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分,转膜（硝酸纤维素薄膜）,方法：,DAB：3-3-二氨基联苯胺,Thank You,
