1、等电点聚焦测蛋白质等电点1实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。2实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF 实质就是在稳定的 pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的 pH 梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的 pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为 0 的区带，这时的 pH 则是这种分子的 pI。聚焦在等电点的分子也会不
2、断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于 pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向 pI 迁移。因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在 pI 处得以“聚焦” 。3实验步骤1.凝胶制备 按表 1 的比例配制 4ml 工作胶液，在真空干燥器中抽气 10min。每组 4 管，每管加胶液 1.8ml。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖 3mm 厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置 2030min 即可聚合。表 1 凝胶工作液配比 凝胶母液（丙烯酰胺 30%：甲叉双丙烯酰胺 0.8%）1ml10%过硫酸铵 0.02ml水
3、2.68ml载体两性电解液 0.15ml蛋白样品液 0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2.电泳 吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加入 0.2的 500ml 硫酸作正极；上槽加入 0.5的 800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为 300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约 30min后，停止电泳，全程约需 3h。 3.剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头” ，负极为“尾” ，正极端呈酸性，负极端
4、呈碱性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。 4.固定取其中的凝胶条 3 根置于一个小培养皿内，倒入 10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液用直尺量出胶条长度 L1和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度 L2。 5.pH 梯度的测量切段法：将未经固定的 1 根胶条，按照从正极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序切成相等的 10 段，按次放人有标号的、装有 0.0lM 氯化钾的试管中，浸泡过夜。然后用 pH 计测出每管浸泡液的 pH 并记录。 4实验结果1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置凝胶条编号 1 2 3 4固定前的长度L07.
5、8cm 7.8cm 7.4cm 7.7cm固定后的长度L17.7cm 7.8cm 7.4cm蛋白带距酸端距离 L21.3cm 1.4cm 1.3cm蛋白质距正极实际长度 LS1.32cm 1.4cm 1.3cm未染色，测pH 梯度2.pH 梯度表及其相应标准曲线标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10长度/cm0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77pH 值 3.05 3.72 5.04 6.76 7.24 7.99 8.62 9.58 10.1410.18蛋白质样品等电点的计算 ：蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度=固定后的
6、蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离*固定前凝胶条长度/ 固定后凝胶条长度则将上述数据代入 LS=L2* ，求出蛋白质距正极实际长度 LS分别为101.3cm、1.4cm、1.3cm。由凝胶条 1、2 和 3 及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距离：(1.3+1.4+1.32)/3=1.34计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从 pH 梯度曲线上求出该蛋白质等电点。得出其标准公式为：y = 0.8372x + 2.6273则待测蛋白质的等电点为 0.8372*1.34+2.6273=3.755实验分析及讨论（1）实验结果测得的样品蛋白的等电点为 3.75，通过查常见蛋白质
7、等电点参考值表格可知，其为 -卵黄脂磷蛋白。由于记录凝胶长度及蛋白质距正极的距离存在读数误差，所以也可能是伴花生球蛋白（3.7-5.0） 。（2）等电点聚焦测蛋白质等电点分辨率高，可将等电点相差 0.010.02pH 单位的蛋白质分开。不像一般电泳易受扩散作用影响，使区带越走越宽；聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。同时，很稀的样品也可以聚焦而浓缩，实验操作起来也简单方便。（3）其存在其不足之处是在实验操作过程当中，读数的取值、样品溶液是否含盐、在等电点时蛋白质是否溶解或变性，都会影响实验结果。因为盐会增大电流量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。由于这些影响因素的存在，个人认为利用这一种方法还不足以鉴定出蛋白质种类。附 常见蛋白质等电点参考值
