1、蛋白质的定量测定（BCA 试剂盒法）实验报告一、实验目的：掌握 BCA 法测定蛋白质浓度的方法及原理。二、实验原理：在碱性的环境下蛋白质与 Cu2+络合并将 Cu2+还原成 Cu1+。BCA 法与 Cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在 562nm 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。三、实验材料：实验药品和试剂：BCA Reagent 100 ml （普利莱基因技术有限公司） Cu Reagent 2.5ml （普利莱基因技术有限公司）BSA standard 4mg/ml 1 ml 待测溶液 。仪器：96 孔板 酶标分析仪（DNM-9602 北京普朗新技术有限公司）
2、移液枪 试管 EP管 恒温水浴箱。四、实验方法与步骤：（1）工作溶液配置：将 5ml 的 BCA Reagent 与 100l 的 Cu Reagent 混合为 WR 工作试剂。（2）标准蛋白溶液的配置：用上节课已配置好的 0.1M 的 PBS 缓冲液进行配比稀释：40l 4000g/ml BSA+60l 0.1M 的 PBS=100l （BSA=1600g/ml） 。（3）倍比稀释：为减小误差，将标准蛋白和待测样本分为三个相同组，每个孔加 25l，浓度从上到下依次增加，H 行为待测溶液。从配置好的 100l 标准蛋白溶液中取出75l（浓度为 1600g/ml） ，再将 75l 标准蛋白溶液取
3、出一半到 EP 管中，将 37.5l 的PBS 缓冲液加入取出的蛋白溶液中（浓度为 800g/ml） ，在 EP 管上做好浓度标记，依次倍比稀释，得到 BSA 标准溶液 1600，800，400，200，100，50，25g/ml，各 75l。省略 1600g/ml 标准管直接从 800g/ml 开始。（4）标准测定：在每孔 25l 标准品或待测样品中，各加入 200l WR 工作液轻摇混合。表 1 微板测定方案的加样量和比例标号 蛋白浓度（ug/ul） 标准或待测蛋白体积 （ul） WR 工作试剂(ul)A 0 25 200B 25 25 200C 50 25 200D 100 25 200
4、（5）反应：将配好溶液的 96 孔板 37恒温水浴箱放置 30min。（6）测定：30min 后将 96 孔板放进酶标分析仪中进行结果的检测，以 A1 做参比，在562nm 波长下比色，记录吸光值。（7）绘制标准曲线图：根据记录的数据，以浓度为 X 轴，吸光度为 Y 轴，绘制标准曲线图。五、实验结果：表 2 各孔测得的 OD 值 表 3 浓度及平均值1 2 3A 0.000 0.000 0.000 B 0.000 0.000 0.000 C 0.000 0.000 0.000 D 0.029 0.012 0.014 E 0.111 0.095 0.081 F 0.227 0.209 0.207
5、 G 0.448 0.476 0.466 H 0.619 0.646 0.628 标 准 曲 线y = 0.0006x - 0.0219R2 = 0.9943-0.1000.0000.1000.2000.3000.4000.5000 200 400 600 800 1000BSA标 准 蛋 白 浓 度 （ g/ml）各标准管对应的OD562值平 均 值线 性 (平 均 值 )图 1 标准曲线图将待测溶液吸光度带入公式 y = 0.0006x - 0.0219 可得待测溶液的浓度为 1088g/ml 。E 200 25 200F 400 25 200G 800 25 200H 待测 25 200
6、浓度 平均值0 0.000 25 0.000 50 0.000 100 0.018 200 0.096 400 0.214 800 0.463 X 0.631 六、结论与讨论：经过试验最终测得待测溶液的浓度 1088g/ml，本次实验所用 BCA 蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，经济实用，试剂及形成的颜色复合物稳定性好。本次试验中出现的问题主要有：前三组数据吸光度结果都为 0，考虑因浓度太低或者与工作液混合不均匀所导致。七、注意事项：（1）加入标本时需充分摇匀。（2）要得到更为精确的蛋白浓度的结果，每个蛋白样品均需做复孔，每次均应做标准曲线。（3）实用水浴箱时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。（4）在 562nm 处测得的光密度值与蛋白质的浓度成正比，所以所做的标准曲线的图形应该为直线图，并且成正比的关系。
