1、病毒的红细胞凝集实验（HA）和凝集抑制实验（HI）,一、实验目的,1、掌握HA实验和HI实验和操作方法。 2、掌握病毒凝集价（抗原效价）和凝集抑制价的判断。 3、掌握鸡心脏和翅静脉采血法。 4、掌握不同浓度红细胞悬液的制备。,二、实验原理,某些病毒表面含有血凝素，能与鸡红细胞表面的粘蛋白受体结合，使红细胞发生凝集，称为病毒的红细胞凝集现象，简称血凝现象。这种病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称病毒的红细胞凝集抑制现象（HI），简称血凝抑制现象。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 该试验适合于血清中新城疫、禽
2、流感及减蛋综合征抗体效价的检测。,三、在生产中的应用,1、检测血清中的抗体水平，根据抗体效价的水平确定免疫时机。 2、免疫后及时监测，确认免疫效果。 3、辅助诊断病毒性疾病 病毒凝集红细胞的特性能被对应的抗体抑制。,四、实验材料,以新城疫抗体效价检测为例 仪器：96孔V型微量反应板、振荡器 1台（振荡96孔V型板） 、微量移液器等。 材料：新城疫浓缩抗原、1%的鸡红细胞悬液、生理盐水、待检鸡的血清。,1%红细胞悬液制备,1、抗凝血的制备 采集3只非免疫成年健康鸡血液，由翅静脉或心脏采血，按3.8%柠檬酸钠与血液1：4混合制成。 2、1%红细胞悬液制备 将抗凝血加入离心管内，用生理盐水洗涤5次，
3、每次2000r/min离心5min ，将血浆、白细胞充分弃去，最后一次离心时间为10min，离心结束后，弃去上清液，根据剩下的红细胞体积，用生理盐水配制成1%红细胞悬液。,五、实验方法与步骤,1、加稀释液 用微量移液器向反应板的第112孔各加生理盐水50微升。 2、首先用灭菌的生理盐水将鸡新城疫浓缩抗原作5倍稀释。然后用微量移液器吸取5倍稀释的抗原50微升于第一孔中，并反复吹打45次，混匀后吸出50微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸出50微升弃去；第12孔不加抗原作为红细胞对照。,（一）血凝实验（HA),抗原稀释倍数,3、加1%的鸡红细胞悬液 用微量移液器向112孔各加1%红细
4、胞悬液50微升。 4、置于微量振荡器上，振荡1分钟。 5、室温静置1520分钟后观察结果。,6、结果观察：方法1：从平面观察，红细胞为一小圆点沉于孔底者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，说明红细胞被病毒所凝集。如下图,方法2：将反应板倾斜45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。如下图,7、判定结果,（1）病毒凝集价（抗原效价）的判断：能使鸡红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数，称为该病毒凝集效价，以2的指数表示。,病毒凝集价为
5、28,2、 4单位抗原的配制 凝集价稀释倍数中所含病毒量为1个凝集单位的病毒。凝集价前面第二孔所含病毒量为4单位病毒。 抗原应稀释的倍数=血凝滴度/4例：上图抗原效价为28，也就是说在第8孔中病毒的含量为1个凝集单位，那么第6孔中病毒的含量为4个凝集单位。则4单位抗原应将原抗原作26（64）倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.3毫升生理盐水。,五、实验方法与步骤,1、加稀释液 用微量移液器向反应板的第112孔各加生理盐水25微升。 2、倍比稀释被检血清 用微量移液器吸取待测血清液25微升于第一孔中并反复吹打45次，混匀后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升；12孔不加血清
6、作抗原对照。,（二）血凝抑制实验（HI),血清稀释倍数,3、加4单位抗原 112孔各加25微升。 4、置于振荡器上，振荡1分钟，室温静置 20分钟。 5、加1%的鸡红细胞悬液 用微量移液器向112孔各加1%红细胞悬液25微升。 6、置于振荡器上，振荡1分钟。室温静置2025分钟后观察结果。,7、结果观察：方法1：从平面观察，如果红细胞为一小圆点沉于孔底者，表明红细胞未被病毒凝集，即凝集现象被抑制；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，说明红细胞被病毒所凝集，即凝集现象未被抑制。,方法2：将反应板倾斜45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被病毒凝集，即凝集现象被抑制
7、；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集，即凝集现象未被抑制。,8、判定结果,（1）血清抗体效价的判断：能够使4单位病毒凝集鸡红细胞的作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的抗体效价，以2的指数表示。,上图，血清抗体效价依次为28、 27、28、29、28、27、27、26,孔号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,2、判定标准：（1）一般认为鸡的免疫临界水平为25（成鸡）或26（雏鸡）。 （2）鸡血清的凝集抑制价，全部高于26可适当推迟新城疫免疫时间，全部低于24以下，应马上进行新城疫疫苗接种。,七、注意事项,1、制作1%
8、红细胞悬液所采用的鸡，应为未接种过新城疫疫苗的健康鸡。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。 2、每加一种样品都要换一个移液器的滴头，以影响实验结果。 3、1%红细胞悬液4保存，使用时轻轻摇匀，做同一次实验或测同一批样品不能更换更换红细胞，正常保存3天的红细胞不影响实验结果。,七、注意事项,4、温度对试验结果也有影响，一般要求在室温25-37进行实验，当温度低于4时红细胞有时会发生自凝现象。冬季做该实验时由于环境温度过低，最好将反应板置于30温箱中。 5、96孔V型微量反应板是否洗净，是否光滑也会影响实验结果。96孔微量反应板的清洗方法：将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，
9、用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37温箱中干燥。,？思考题,1、如何进行禽流感H5、H9的抗体测定？如果检测被检血清中禽流感H5、H9的抗体效价，只需将新城疫抗原换为禽流感H5、H9抗原即可，检测方法完全相同。 2、怎样通过HI试验鉴别新城疫和禽流感？,八、实验后用具的处理,1、用过的反应板、微量滴头先用流水冲净，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中（ 70以下），烤干备用。 2、清洁液的配制：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。,
