1、广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786 1Kernel呋喃它酮代谢物酶联免疫反应试剂盒说明书 (货号：EVAMOZ-01) 1概述Kernel 呋喃它酮代谢物酶联免疫反应测试盒是用于检测饲料、鱼、虾、肉类组织（牛肉、鸡肉和猪肉） 、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿液中呋喃它酮代谢物的残留量。该试剂盒特点包括： 快速(4小时)，高回收率(80-95%)，多种样品的低成本提取方法。 高灵敏度（0.025ng/g或者0.025ppb） ，低检测下限（0.
2、05ng/g） 。 检测过程只需要不到1小时。 高重复性。2试剂盒原理Kernel 呋喃它酮代谢物酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，含有呋喃它酮代谢物的药物抗原已经包被于微孔板上，在分析时，样品中药物特异性地与抗体相结合。如果药品中有药物存在，它将阻止包被于微孔板上的药物与抗体结合。当与样品药物相结合的药物抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，与经酶标记物相结合。反应后颜色深度与样品中呋喃它酮代谢物的含量成反比。3.试剂盒组成部分和储存内容物 规格 保存呋喃它酮代谢物包被板 96 孔板（128 孔） 2-8呋喃它酮代谢物标准品：0ng/ml 阴性质控0.025ng/mL0.
3、1ng/mL0.4ng/mL0.8mL0.8mL0.8mL0.8mL0.8mL2-81.6ng/mL6.4ng/mL 0.8mL回收用 10ng/ml 0.8mL 2-81HRP 酶结合物 6 mL 2-810浓缩洗液(Wash Solution) 50mL 2-8广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786 2终止液(Stop Buffer) 12mL 2-8TMB 底物(TMB Substrate) 12mL 2-810样品提取液 (Extra
4、ction Buffer) 50ml 2-85mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitrobenzaldehyde) 12ml 2-84.样品检测下限样品 检测下限虾/鱼/肉 0.05饲料 0.1鸡蛋/蛋粉 0.05蜂蜜 0.05牛奶 0.05血清 0.05尿液 0.055.交叉反应硝基呋喃类 交叉反应 (%)呋喃它酮 AMOZ 100呋喃唑酮 AOZ 0.04呋喃妥因 AHD 0.06呋喃西林 SEM 0.056未提供的设备或材料1) 酶标仪(450nm)2) 匀质器3) 漩涡振荡器4) 微量加样器(10、20、100 和 1000L 各一支)5) 多道枪：50-300L6) 乙酸乙酯 7) 正己烷
5、(或正庚烷)广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786 38) 1M NaOH9) 1M HCL7.注意事项实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。1) 标准品中含有呋喃它酮代谢物，请小心使用。2) 不要使用过期的试剂盒。3) 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保酶结合物及酶结合物稀释液正确配制。4) 尽量保持室温（22.52.5）C，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，
6、防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。8样品的制备样品保存在 2-4不超过 1-2 天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20。样品使用前应恢复到室温。1样品缓冲液按 1：9 的比例配制 10浓缩样品缓冲液和双蒸馏水，举例：取 1ml 的 10浓
7、缩样品缓冲液加入到 9ml 双蒸馏水中，配制成 10ml 的 1样品缓冲液，按需要，可同比例放大或缩小。1M 盐 酸溶液举例：取 8.3ml 的 36%盐酸溶液定容到 100ml 的双蒸馏水中。按需要，可同比例放大或缩小。1M 氢 氧化 钠溶液举例：称取 4g 的氢氧化钠粉末溶解到 100ml 的双蒸馏水中。按需要，可同比例放大或缩小。鱼/虾/肉（牛肉/鸡肉/猪肉）衍生反应（1） 称取 1g 匀质样品，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl 和 200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；（2） 37C 恒温培养 16 小时，静置过夜，或者 60C 恒温培养 3 小时。
8、 提取步骤（1） 加入 5mL 的 1缓冲液，0.4ml 的 1M 的 NaOH，6ml 乙酸乙酯，涡旋振荡 1 分钟；（2） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（3） 取 3mL 上清液(相当于 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，于 50C 减压蒸馏或 50C 水浴氮气吹干；广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786 4
9、（4） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入 1mL 的 1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡 1 分钟；（6） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（7） 去除上层正己烷，取 100 L 下清液，进行样品测试。稀 释 倍数： 2.02.2 蜂蜜衍生反应（1（ 称取 1g 蜂蜜样品，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl 和 200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；（2（ 37C 恒温培养 16 小时，静置过夜，或者 60C 恒温培养 3 小时。提取步骤（1（ 加入 5mL 的 1缓冲液，0.4mL 的 1M
10、的 NaOH，6ml 乙酸乙酯，涡旋振荡 1 分钟；（2（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（3（ 取 3mL 上清液(相当于 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，于 50C 减压蒸馏或 50C 水浴氮气吹干；（4（ 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5（ 加入 1mL 的 1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡 1 分钟；（6（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（7（ 去除上层正己烷，取 100 L 下清液，进行样品测
11、试。稀 释 倍数： 2.02.3 饲料I 衍生化步骤（1（ 称取 0.5g 均质饲料，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 的 1M 盐酸溶液，200uL 衍生化试剂，涡旋振荡约 1 分钟左右。（2（ 于 37 恒温箱静置培养 16 小时，或者 60C C 恒温培养 3 小时。II 提取步骤（1（ 加入 5mL 的 1缓冲液，0.4mL 的 1M 氢氧化钠溶液，6mL 乙酸乙酯，涡旋振荡混匀。（2（ 室温下用离心机以离心力 4000g 离心 10 分钟。（3（ 移取 3mL 上清液到干净离心管中，于 50 水浴氮气吹干，或者 50 旋转蒸发仪蒸干样品。（4（ 加入 1mL 正己烷来溶解干燥样品。（
12、5（ 加入 1mL 的 1洗液/提取液，涡旋振荡 1 分钟左右。（6（ 室温下用离心机以离心力 4000g 离心 10 分钟（如不分层，则振荡后于沸水中加热 3 分钟左右再进行离心） 。（7（ 取下清液 100uL 进行分析。稀 释 倍数： 4.02.4 鸡蛋/蛋粉广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786 5衍生反应（1（ 称取 1g 匀质鸡蛋样品，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl 和 200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈
13、振荡 1 分钟；（2（ 37C 恒温培养 16 小时，静置过夜，或者 60C 恒温培养 3 小时。提取步骤（1（ 加入 5mL 的 1缓冲液，0.4mL 的 1M 的 NaOH，6ml 乙酸乙酯，涡旋振荡 1 分钟；（2（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（3（ 取 3mL 上清液(相当于 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，于 50C 减压蒸馏或 50C 水浴氮气吹干；（4（ 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5（ 加入 1mL 的 1样品提取液 / 洗
14、液，最大速度涡旋振荡 1 分钟；（6（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（7（ 去除上层正己烷，取 100 L 下清液，进行样品测试。稀 释 倍数： 2.02.5 牛奶对于含脂牛奶，取 3mL 牛奶样品，室温（ 22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟，去除上层脂肪层。衍生反应（1（ 取 1mL 牛奶样品，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl 和 200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；（2（ 37C 恒温培养 16 小时，静置过夜，或者 60C 恒温培养 3 小时。提取步骤（1（ 加入 5mL 的 1缓冲液，0.
15、4mL 的 1M 的 NaOH，6ml 乙酸乙酯，涡旋振荡 1 分钟；（2（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（3（ 取 3mL 上清液(相当于 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，于 50C 减压蒸馏或 50C 水浴氮气吹干；（4（ 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5（ 加入 1mL 的 1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡 1 分钟；（6（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（7（ 去除上层正己烷，取 100 L
16、下清液，进行样品测试。稀 释 倍数： 2.02.6 血清衍生反应（1（ 称取 1g 血清样品，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl 和 200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；（2（ 37C 恒温培养 16 小时，静置过夜，或者 60C 恒温培养 3 小时。提取步骤（1（ 加入 5mL 的 1缓冲液，0.4ml 的 1M 的 NaOH，6ml 乙酸乙酯，涡旋振荡 1 分钟；广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786
17、6（2（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（3（ 取 3mL 上清液(相当于 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，于 50C 减压蒸馏或 50C 水浴氮气吹干；（4（ 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5（ 加入 1mL 的 1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡 1 分钟；（6（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（7（ 去除上层正己烷，取 100 L 下清液，进行样品测试。稀 释 倍数： 2.02.7 尿液衍生反应（1
18、（ 取 3mL 尿液样品，室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟。（2（ 取 1mL 尿液上清液，加入 4mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl 和 200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；（3（ 37C 恒温培养 16 小时，静置过夜，或者 60C 恒温培养 3 小时。提取步骤（1（ 加入 5mL 的 1缓冲液，0.4ml 的 1M 的 NaOH，6ml 乙酸乙酯，涡旋振荡 1 分钟；（2（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（3（ 取 3mL 上清液(相当于 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如
19、果移取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，于 50C 减压蒸馏或 50C 水浴氮气吹干；（4（ 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5（ 加入 1mL 的 1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡 1 分钟；（6（ 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 10 分钟；（7（ 去除上层正己烷，取 100 L 下清液，进行样品测试。稀 释 倍数： 2.09 检测步骤试剂准备注意：试剂在使用之前要在室温下解冻 1-2 小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶
20、子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。1工作洗液/提取液按 1： 9 的比例配制 10浓缩洗液/提取液和双蒸馏水，举例：取 10ml 的 10浓缩洗液/提取液加入到 90ml 双蒸馏水中，配制成 100ml 的 1工作洗液/提取液，按需要，可同比例放大或缩小。检测：以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。广 州 市 瑞 品 生 物 技 术 有 限 公 司地址：广州市海珠区新港东路致远街 32 号 电话：020-89883786 89237038 34094537 传真：020-89883786 7试剂 每个反应需要的体积 24 次反应的体积HRP 酶标抗原
21、 50 L 1.2mL工作洗液 1 mL 24mL终止液 100 L 2.4 mL底物 100 L 2.4 mL（1） 加入 100L 的标准品或样品于所设定的孔中；（2） 在每孔中加入 50L 的 AMOZ-HRP 酶标抗原， 轻敲微孔板混匀 60 秒；（3） 室温（22.52.5）C 避光孵育 30 分钟；（4） 洗板 3 次，每次应该加入 250L 1洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；（5） 每孔加入 100L 的 TMB 底物；在室温（22.52.5）C 下避光培养 20 分钟后，加入 100L 的终止液终止反应，稳定两分钟后，在 450nm 下读 OD 值(读数前，用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指模)。10结果计算（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。（2） 相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) 100 （3） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。（4） 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
