1、呋喃唑酮(furazolidone)又称痢特灵，属硝基呋喃类药物，是人工合成的具有 5- 硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，对革兰氏阳性及阴性菌均有一定的抗菌作用，因此被广泛应用于家禽、家畜、水产品中的疾病预防和治疗。近年研究表明，呋喃唑酮及其代谢物具有致基因突变性和致癌性1，因此引起了世界各国的高度重视。美国 1993 年禁止呋喃唑酮作为兽药2，欧盟从 1997年开始将所有的硝基呋喃类抗生素列为违禁药物3，我国农业部第 235 号公告中也规定动物性食品中呋喃唑酮检出限为不得检出4。由于呋喃唑酮在体内代谢很快，对其原药的检测难度较大，而其代谢产物以蛋白结合态的形式可在组织中长期稳定存在，因此管理
2、部门可通过检测组织中的呋喃唑酮代谢物(AOZ)来检测呋喃唑酮的残留5-6。目前文献报道的呋喃唑酮代谢物的酶联免疫法大都是针对水产品的，且检测时间较长，最低检测限较高，如宋琍琍等7使用酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物的残留，所用试剂盒的灵敏度和检测限分别为 0.05g/L 和0.3g/kg，样品加标回收率为 86.8%96.9%，检测时间 75min。目前，动物组织中呋喃唑酮及其代谢物的残留分析主要采用高效液相色谱法、液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)仪器方法6,8-11 和酶联免疫法 (ELISA)1,7,12-13。前者由于需要复杂的仪器设备、繁琐的前处理过程及对检验人员的高技能要求，
3、不适合现场监控和大量样本的筛查，而以抗原抗体特异性反应为基础的酶联免疫法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已在农兽药残留检测中得到广泛应用。本实验应用酶联免疫法测定猪肉中呋喃唑酮代谢物的残留量，以对试剂盒的性能进行评价。1材料与方法1.1材料与试剂猪肉 市售。呋喃唑酮代谢物(AOZ)ELISA 检测试剂盒(包括包被有偶联抗原的 96 孔酶标板，质量浓度分别为 0、0.025、0.075、0.225、0.675、2.025g/L 的呋喃唑酮代谢物标准液，酶标二抗，抗体浓缩液，单组分底物液，终止液，20 浓缩洗涤液，2 浓缩复溶液和 2- 硝基苯甲醛) 北京勤邦生物技术有限公司；呋喃唑酮代谢
4、物标准品(纯度99%) 美国 Sigma 公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2仪器与设备8010S 匀浆机 上海斯伯明仪器设备有限公司；2000SBL 电子天平 美国 Setra 公司；KS-振荡器 上海跃进医疗器械厂；Anke GL-20G- 高速离心机 上海安亭科学仪器有限公司；DSY- 氮吹仪 北京金科精华苑科技有限公司；QL-901 漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；微量移液器(单道 20200、1001000L，多道 50300L)、K3 酶标仪 美国 Thermo公司；Acquity 液相色谱串联质谱仪(配有电喷雾离子源)美国 Waters 公司。1.3方法1.3.1样品
5、前处理称取(1.00.05)g 匀浆后的样本至 50mL 聚苯乙烯离心管中，加入 4mL 去离子水、0.5mL 1mol/L 盐酸和 100L衍生化试剂(向装有 2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至 10mL 即可)，用振荡器充分振荡 2min，37过夜孵育；然后加入 5mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液、0.4mL 1mol/L 氢氧化钠溶液和 5mL 乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡 30s，4000r/min 室温(2025) 离心 10min；取2.5mL 乙酸乙酯相至 10mL 干燥玻璃试管中，于 5060水浴氮气流下吹干；加入 1mL 正己烷，用漩涡混合器涡动 30s，再加入 1
6、mL 复溶工作液，用漩涡混合器涡动1min 充分混匀；于 4000r/min 室温(2025) 离心 10min，除去上层有机相，取下层水相 50L 用于分析。1.3.2ELISA 检测步骤取出所需数量的微孔板，记录标准品和样品的位置；加入标准品或待测样品溶液 50L 到对应的微孔中，再加入 50L 酶标二抗和 50L 抗体工作液(将抗体浓缩液用复溶工作液按照体积比 1:4 进行稀释)，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 30min；倒出孔内液体，用洗涤工作液 250L/ 孔充分洗涤 45 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干；加入单组分底物液 100L/ 孔，轻轻振荡混匀，用盖
7、板膜盖板后置 25避光环境中反应15min，加入终止液 50L/ 孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 波长处测定每孔的吸光度。1.3.3标准曲线的建立分别测定 0、0.025、0.075、0.225、0.675、2.025g/L呋喃唑酮代谢物标准液的吸光度，根据下式计算相对吸光 度 。A 相对吸光度/% 100A0 式中：A 为标准品或样品溶液的吸光度； A 0 为空白溶液(质量浓度为 0g/L 标准溶液)的吸光度。以标准品相对吸光度为纵坐标(Y)，呋喃唑酮代谢物标准品质量浓度的对数为横坐标(X)，绘制标准曲线：Y0.3651lgX1.226 ，其中 IC50 值为 0.082g/L，R20.9916。将样品相对吸光度代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的质量浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中呋喃唑酮代谢物的实际质量浓度。2结果与分析 2.1方法检测限对 20 份空白猪肉样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各相对吸光度的样品质量浓度，以 20 份样品呋喃唑酮代谢物质量浓度的平均值(x)和标准差(s) 表示检测限(MDL)，即 MDL=x 3s，结果得该方法对猪肉样品的检测限为 0.1g/kg
