1、免疫组织化学技术概述,2012.9,应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或 细胞标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进 行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组 织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞 化学（immunocytochemistry）技术。,？,抗原 抗体,？,？,（一）免疫细胞化学/称免疫组织化学原理:通过特异的抗原、抗体（标记上可见的显示物）反应系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。此方法可以识别定位各种细胞组织成分， 如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌、病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）
2、等，一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。,抗原 (antigen, Ag) 抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反 应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性： 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋巴细胞的特性；免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 根据抗原是否显示免疫原性分为：-完全抗原; -半抗原: 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。,抗体 (antibody, Ab) http:/ 概念：机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。 抗体主要存
3、在于血清内, 抗体都是免疫球蛋白，分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细 胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物 血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。,？,抗体制备：多克隆抗体的制备 *动物的选择 *佐剂(adjuvant) *免疫方法 *免疫剂量 *抗体效价的测定 *放血或定期抽血,常用标记物：荧光素（FITC)酶(HRP)亲和素；生物素；铁蛋白；胶体金。,http:/juang.bst.ntu.e
4、du.tw/ECX/monoclonal.htm,抗体制备：多克隆抗体的制备 *动物的选择 *佐剂(adjuvant) *免疫方法 *免疫剂量 *抗体效价的测定 *放血或定期抽血,常用标记物：荧光素（FITC)酶(HRP)亲和素；生物素；铁蛋白；胶体金。,取材、制片、孵育、观察、记录、分析,免疫细胞化学/称免疫组织化学方法,？,抗原修复原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键致使部分抗原决定簇被封闭；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，使固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。,？,取材、制片
5、、孵育、观察、记录、分析,免疫细胞化学/称免疫组织化学方法,抗原修复方法 化学方法: 消化。胰蛋白酶、胃蛋白酶、Laminin、CollagenIV 加热方法：水浴加热法、微波照射法、高压加热法、酸水解法 水浴加热法：*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。 微波照射法：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95以上，持续l015分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。 高压加热法暴露抗原：将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压,（二）免疫组织化学染色方法按染色步骤直接法(又
6、称一步法)间接法(二步、三步或多步法) 按标记物质的种类如荧光染料-免疫荧光法放射性同位素-放射免疫法酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)-酶标法铁蛋白、胶体金-免疫金银法。 按结合方式抗原抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法亲和连接：如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、* 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等,一、直接法 用标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，使标记物沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。,优点：简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。 缺点：每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物，且敏感性较间接法低。,
7、按染色步骤分类,直接法 1检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与标 记物结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，继之显示标记物，在显微镜下即可见抗原存在部位（荧光标记则呈现特异性荧光，酶标记则需进行酶组织化学显色）。此法很特异和简便，但一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。 2检查抗体法 将抗原用标记物标记，即为标记抗原，用此抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。,二. 间接法：,原理：先用未标记的特异性抗体(一抗）与标本中相应抗原反应，再用抗特异性抗的标记抗体与结合在抗原上的一抗（即特异性抗体）反应。例如，第一次使用的特异性抗体(一 抗）是由家兔
8、产生的，则第二次使用的抗体（二抗）必须是标记的抗兔的免疫球蛋白，常用的羊抗兔lgG的标记物（即标羊抗兔IgG）。然后与直接法相同。,优点：是用一种酶标抗体就可与多种特异性一抗配合而检查多种抗原，而且敏感性也优于直接法。,检测：在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质、定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。,荧光标记抗体,酶标记抗体,1. 免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出
9、一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。,按标记物质的种类分类,组织化学（histochemistry)细胞化学 (cytochemistry),2.免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。 基本原理:是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光
10、、电镜研究等。,Carcinoembryonic antigen is a protein present in several malignant tumors mainly of the breast and intestines. This photomicrograph is an immunocytochemical demonstration of carcinoembryonic antigen in a section of large intestine adenocarcinoma. The antibody was labeled with peroxidase, and
11、 the counterstain was hematoxylin. Medium magnification.,癌胚抗原 （大肠腺癌）过氧化物酶标记，苏木素复染,免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法、ABC法、SP法等-亲和免疫组织化学.亲和素生物素-过氧化物酶复合物特点是将亲和素作为“桥”与生物素化的抗体和生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。,（Avidin-biotin peroxidasecomplex, ABC）技术原理：,生
12、物素 (biotin) 为含硫的杂环单羧酸，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶。亲和素(avidin) 又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。,生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有4个生物素结合位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC混合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。,a,b,c,d,抗原,抗体-生物素,亲和素-荧光素,荧光显微镜观察、拍照,荧光染料： 1。吖啶橙（Acridine orange);碱性，最大吸收波长495，最大荧光波长530630，能
13、染细胞核，粘液及细菌 ，呈黄绿色荧光。 2。吖啶黄（Acriflavine):碱性，最大吸收波长455，最大荧光波长450700，染细胞和细菌。呈黄绿-桔黄色荧光。 3。异硫氰酸荧光素（FiTc):酸性，最大吸收波长495，最大荧光波长490610，染细胞，蛋白质标记（免疫荧光抗体）。呈黄绿色荧光。 4。樱草素（Primulin):酸性，最大吸收波长360，最大荧光波长400500，染细胞和细菌。呈蓝色荧光。,5。罗达明B(Rhodamine B): 碱性，最大吸收波长560，最大荧光波长540660，染细胞，蛋白质标记，细菌。呈橙红色荧光。 6。金胺 O(Auramineo): 碱性，碱性，
14、最大吸收波长435，最大荧光波长490590，染细胞，细菌。呈绿色-金黄色荧光。 7。曲利本兰（ Trypanblue):酸性，最大吸收波长405，最大荧光波长530630，染弹性纤维。呈亮红色荧光。 8。荧光素(Fluorescein):酸性，最大吸收波长405，最大荧光波长480，染细胞和细菌。呈蓝绿色荧光。,tub / tub,RPE,ONL,INL,GCL,IS,OS,a,b,c,tub / Trx,tub / wt,视网膜 p-Ask1的表达,结果： Tub/Trx 小鼠p-Ask1与Tub/tub小鼠比较有显著差异(p0.05).,R1D4,PNA,DAPI,视网膜原代细胞培养,免
15、疫组织化学SABC法原理示意图, 链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物技术 (streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法) ,ABC技术具有以下优势：（1）敏感性强。Hsu等应用ABC法与PAP法相比发现其敏感性较PAP发高2040倍，能显示PAP法所不能显示的抗原。 （2）特异性强。由于敏感性提高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能高的浓度，减少了非特异性染色，背景清晰。 （3）方法简便。由于卵白素和生物素间的极高亲和能力，使得结合时间可明显缩短，符合物的制备操作简便。 （4）由于生物素和卵白素具有和多种示踪物高度亲和的能力，可用于双
16、重或多重免疫染色。,链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法（streptavidin-peroxidase method, SP法）链霉亲和素是从链霉菌中分离出的一种蛋白，含有四个亚基，每个亚基均具有与生物素亲和力极高的结合点。链霉亲和素的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合，故又称链霉菌抗生物素蛋白，它对组织穿透性强，反应速度快。链霉亲和素的等电点为5.56.7，接近中性，所带的负电荷少，不容易与组织中的正电荷发生相互吸引，因而可降低背景着色。此外，链霉亲和素不含糖基，不存在与组织中含糖基类物质起反应的现象。,免疫组织化学SP法原理示意图,该放大系统不含生物素，可以免除由内源性生物素所 造成的背景
17、着色，因此背景清晰，无非特异性染色，阳性 反应物突出，明显易辨。从某种意义上讲，SP法比ABC法 的敏感性至少高一倍以上。由于它的敏感性强，效果好， 因此更受研究者欢迎。,3 免疫胶体金技术 原理：是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。 胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白， 对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金
18、本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。,Electron micrograph showing a section of a pancreatic acinar cell that was incubated with anti-amylase antibody and stained by protein A coupled with gold particles. Protein A has high affinity toward antibody molecules. The gold particles appear as very sm
19、all black dots over the mature secretory granules and the forming granules in the Golgi complex. (Courtesy of M Bendayan.),免疫电镜（胶体金标记）,阴性,阳性,优点多胶体金溶液可以重复制备，其颗粒大小可以控制，可较容易进行免疫电镜的双重或多重标记；金标探针有很高的电子密度，有特殊的分辨率，定位准确；金标探针能发射二次电子和反射电子，是扫描电镜目前最理想的标记物；金标探针与组织细胞内的抗原结合后，可用银增强，大大提高了IHC的敏感性，是目前最为敏感的IHC方法之一；免疫金银染
20、色方法无致癌性，使用较安全。,五、对照试验 为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以上对照试验： 1直接法 需设下述对照试验 （1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。 （2）抑制试验：可分为二步法和一步法。 二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。 一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。此法效果较二步法好，并且简便。,（3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧
21、光 。 如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。 2间接法 （1）自发荧光对照：同上（一）。 （2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。 （3）抑制试验：同上。 （4）阳性对照：同上。 对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。,免疫组织化学技术这种方法具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等优点，又能够有机的同形态、功能及代谢的研究结合起来，用以研究其它技术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。免疫细胞化学对生物医学基础研究及预防和临床医学的发展，对军事医学的应用价值，引起当今世界各国的重视。
22、 免疫组化的应用是肿瘤病理诊断技术的一次飞跃，它将形态学观察和抗原抗体反应的特异性以及免疫标记技术的敏感性相结合，可以在组织原位显示肿瘤所含的抗原成分，用于肿瘤诊断和鉴别诊断、病因和病变机理的研究。,应用：,应用范围 : 在外科学、组织学、临床实验室中进行各种各 样生物样本处理工作的技术员都是CM1900主要的潜在用户，目前应用于： 1. 为快速病理诊断提供冰冻切片。已成为癌症诊断的重要工具。 2. 细胞学：显示脂肪、脂类以及特种组织成份。 3. 免疫细胞化学、免疫组织化学和分子生物学技术等研究工作。 4. 神经生物学研究。 5. 常规组织胚胎学研究。 6. 皮肤病理学研究。 7. 动脉血管外科学研究。,http:/ 邻苯二醛显示组胺荧光法 免疫组织化学技术 乙醛酸诱发生物单胺荧光法灭活 内源性酶及封闭内源性生物素 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶法 免疫组织化学抗原 修复亲和素生物素过氧化物酶复合物法,
