1、（一）实验前应明确的问题 1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓
2、度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显） 。 4. 培养时间。200ul 的培养液对于 10 的 45 次方的增殖期细胞来说，很难维持 68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在 48h换液的。 5. MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做 MTT 时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。 6.
3、理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8. 避免血清干扰。用含 15胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于 10胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 （二）实验步骤 贴壁细胞： 1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待测细胞调密度至 1000-10000 孔， （边缘孔用
4、无菌 PBS 填充） 。 2. 5%CO2，37 孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板） ,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7 个梯度, 每孔 100ul,设 3-5 个复孔.建议设 5 个，否则难以反应真实情况.3. 5%CO2，37孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT） ，继续培养 4h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。 5. 终止培养，小心吸
5、去孔内培养液。 6. 每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。 7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜） 悬浮细胞： 1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1106/ml，按次序将补足的 1640（无血清）培养基 40ul ；加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培养液稀释 lug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物 10ul；细胞悬液 50ul（即 5104cell/孔） ，共 1
6、00ul 加入到96 孔板（边缘孔用无菌水填充） 。每板设对照（加 100ul(储存液 100 1640） 。 2）置 37，5%CO2 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT） ，继续培养 4 h。 （悬浮细胞推荐使用WST-1，培养 4 h 后可跳过步骤 4） ，直接酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000 转 x10min） ，小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570nm（63
7、0nm 校准）测量各孔的吸光值。 5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜） ，每组设定 3 复孔。 （三）MTT 的配制 MTT 一般最好现用现配，过滤后 4避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多, 尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT 有致癌性，用的时候小心, 有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的 M
8、TT 需要无菌，MTT 对菌很敏感；往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。 配制 MTT 时用用 PBS 溶解,也有人用生理盐水配， 60水浴助溶。 PBS 配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na 2HPO4 1.44g，KH 2PO4 0.24g，调 ph 7.4，定容 1L。 （四）关于细胞的接种(铺板) 细胞过了 30 代以后就不要用了, 因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板） ，不好的板或重复利用的板只可做预实验。 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在 10000/ml 左右时，所测得的 OD 值的
9、区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而 MTT 细胞密度多采用 10000/ml，100ul/孔。 细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105,贴壁细胞可为 103-104.（五）加入 MTT 个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和
10、你加入真正起作用的的 MTT 的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确定，我认为 MTT 多加一些比少加好一些 MTT 的量各家报道不同，一般是过量的，所以 10ul 即够了。如果不使用 96 孔板，培养基超过 100ul，MTT 按照 10%的比例加入.加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀，不过这个应该关系不大。 如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大,另外 MTT 稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加 MTT 前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合
11、效应，所以可以单独将药物和 MTT 加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加 MTT 即可。首先说说我的一点经验： 1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3 到 4 倍，可能比较容易混匀。10ml 的离心管里面最好装 34ml 的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。 。 。 2. 吸管的吸液量最好在 1ml 左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml 多的吸管，总液量在 5ml 左右为益 3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，
12、但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 4. 吹打次数 100 左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 3050 次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次，每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中5 秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。 ） 5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左 3 下，向右 3 下，在往返回复 3 下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。
13、（铺板技术是 MTT 实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。 其它的声音： 1. 首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔 1000 个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT 方法也是表现不出的，最佳点板浓度在 4000-5000/孔，太少的话 SD 值会很大。 2. MTT 本身就是比较粗的实验，增殖率 10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20 的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。 3. 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验
14、,这种细胞长的很快一开始我是用 100000/ML 的浓度来接种的, 结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过4000080000/ML 的浓度都做过 MTT 实验, 结果发现做的结果比较好点的是 6000070000/ML的浓度组的.用 40000/M 的浓度的组,由于细胞少, 药物作用的梯度还是有 ,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物 )来确定培养时间是 48 小时还是 72 小时. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV 会在 8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些、快些上板。
