1、第一篇 蛋白质化学,protein,茶学与生物系张 剑,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,（一）蛋白质的重要性质,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,1.蛋白质分子的大小,蛋白质的分子量：一般在1万100万道尔顿(D)之间;测定方法：1）超速离心法2）凝胶过滤法3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法4）化学组成法测定,蛋白质分子量测定,1）超速离心法（沉降分析法）,超速离心机：离心速度 60 000-80 000 r/min;基本原理：蛋白质分子在受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降的速度与蛋白质分子大小、溶剂的密度和粘度有关。沉降系数：单位离心场力的沉降速度，
2、用S表示。 1S=10-13s,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,凝胶：交联葡聚糖，商品名称为 Sephadex;条件：标准蛋白质和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体）。分子为线型或能被凝胶吸附的蛋白质不能用此法测定。基本原理：,蛋白质分子量测定,2）凝胶过滤法(分子排阻层析法或分子筛层析）,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量,SDS:基本原理：PAGE电泳时蛋白质的迁移率与分子的静电荷多少以及分子的大小和形状有关；经过SDS和少量巯基乙醇处理所有蛋白质带相同的负电荷，此时蛋白质的迁移率主要取决于蛋白质的分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。,蛋
3、白质分子量测定,3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,？,加入SDS后蛋白质单体分子构象发生改变，形成的SDS蛋白质复合物的形状为长椭圆棒，迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量。,巯基乙醇破坏二硫键,蛋白质分子量测定,4）根据分子组成测定最低分子量,基本原理：测定蛋白质中某一微量元素的含量，根据其信号换算出蛋白的最低分子量； 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量，其实真实分子量是这个组成成份的n倍。 如：肌红蛋白含0.335%的铁，最低M=16700用其它方法测得实际为16900； 牛血清白蛋白含Trp0.58%，最低M=35
4、200，用其它方法测得实际为69000，说明它只含2个Trp残基。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,（一）蛋白质的重要性质,2.两性解离及等电点,蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的-氨基和-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团如-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 。,第五节 蛋白质的理化
5、性质与分离纯化,（一）蛋白质的重要性质,3.胶体性质,蛋白质的分子量1万-100万之间，其分子直径1-100nm之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。,水化层：蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如-NH3、-SH、-CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成一层水化层（水膜）。电层：蛋白质颗粒表面带有同种电荷，相互排斥，因而蛋白质不易聚集沉淀。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,（一）蛋白质的重要性质,3.胶体性质,蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。,透析：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质
6、，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。（盐析）,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,透析只用于除盐类和小分子杂质,透析只用于除盐类和小分子杂质,（一）蛋白质的重要性质,4.蛋白质沉淀,1）定义：在一定理化因素影响下，蛋白质分子可因失去电荷和脱水而失去稳定性，并发生凝聚作用，沉淀析出，这种作用称为蛋白质沉淀。 2）分类： 可逆沉淀：属非变性沉淀，条件温和，通过改变溶液pH或Pr所带电荷，Pr结构和性质没有变化，用透析等方法除去 沉淀剂后可复溶（盐析法和有机溶剂沉淀法）。 不可逆沉淀：属变性沉淀，条件强烈，破坏Pr胶
7、体溶液稳定性，也破坏Pr结构和性质，沉淀不能再重新溶解(加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等）。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,水化层,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质沉淀,3）常用方法,高浓度中性盐,加入大量的中性盐(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl破坏了蛋白质的水化层，中和蛋白质的电荷，而使蛋白聚集沉淀，这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。 实例： 血清中加(NH4)2SO4至50%的饱和度，球蛋白先沉淀析出，继续加至100%饱和度，则清蛋白沉淀析出。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,蛋白质沉淀,3）常用方法,有机溶剂沉淀法,加入水溶性有机溶
8、剂甲醇、乙醇、丙酮破坏水化膜，降低介电常数增加带电质点的相互作用影响双电层，而使蛋白聚集沉淀，用于蛋白质分离制备。 注意事项：a.低温操作; b.不能长时间接触；c.控制好量； 实例：食品级酶制剂的生产；中草药注射液、胰岛素的制备,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,蛋白质沉淀,3）常用方法,重金属盐沉淀：,Hg2+、Ag+、Pb+ （与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构） 实例：医疗上稀汞试剂消毒灭菌；喝豆浆或牛奶解毒。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,蛋白质沉淀,生物碱试剂和某些酸类沉淀法：,在pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不
9、溶性沉淀。 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸； 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。,加热变性沉淀法：,原因是蛋白质空间结构破坏疏水基团外露因而破坏了水化层。如同时处于等电点更容易沉淀，原因是影响蛋白质的带电状态。如做豆腐。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,5.变性与复性,蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用。,（一）蛋白质的重要性质,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,次级键被破坏 天然结构解体 一级结构没有变化,蛋白质变性与复性,1）化学本质,2）变性因素,物理：热、紫外线照射、高压和表面
10、张力。 化学：有机溶剂、脲、胍、 酸、碱、重金属阳离子、生物碱等。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,生物活性丧失（酶）； 旋光性改变，溶解度降低，粘度增大，光吸收性增强，扩散系数变小； 基团位置改变，疏水基团外露，分子结构伸展松散，对蛋白酶敏感性增大。,蛋白质变性与复性,3）表征,4）应用,有利：变性灭菌、消毒；变性制食品；临床分析 不利：衰老、皮肤变粗糙、干燥，。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,5.变性与复性,（一）蛋白质的重要性质,蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种
11、现象称为复性（renaturation）。大多蛋白质变性后，很难复性。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,核糖核酸酶变性与复性作用,Native ribonuclease,Denative reduced ribonuclease,Native ribonuclease,变性,复性,5.变性与复性,（一）蛋白质的重要性质,分类：可逆变性与不可逆变性 沉淀与变性的关系： 变性蛋白质并不一定都表现沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性（如可逆沉淀）。 不能复性的变性即不可逆变性一定产生沉淀，不可逆的沉淀一定变性。制备活性蛋白质时要严防蛋白质变性。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,6.蛋白质的颜色
12、反应,（一）蛋白质的重要性质,1）双缩脲反应,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。,双缩脲在稀碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。,通常可用此反应来定性鉴定蛋白质； 根据反应产物的在540nm处颜色深浅，进行蛋白质水解程度的测定及蛋白质的定量。,2）黄色反应（定性鉴定）,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,蛋白质加浓硝酸白色沉淀变黄色加碱变橙黄色。因为蛋白中芳香族氨基酸（Try、Phe、Trp），苯基与浓硝酸起硝化作用，产生黄色的硝基取代物，遇碱又形成黄色的盐（硝基
13、苯衍生物）。皮肤遇硝酸变黄,蛋白质的颜色反应,蛋白质的颜色反应,3）米伦反应,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,含有酪氨酸的蛋白质，加入米伦试剂（HgNO3，HgNO2，HNO3，HNO2的混合液）反应，先产生白色沉淀，加热后变成专红色。,4）乙醛酸反应,含有色氨酸的蛋白质，与乙醛酸混合后，沿壁慢慢加入浓硫酸，两液层之间出现紫色环。,蛋白质的颜色反应,5）酚试剂（Folin-酚试剂）反应,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,含酪氨酸蛋白能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物，（即钼蓝和钨蓝的混合物）其在540 nm 有最大光吸收。,6）乙醛酸反应,蛋白质与考马斯亮蓝（G-2
14、50）染液反应产生蓝色络合物，在595 nm有最大光吸收。,蛋白质含量测定方法：凯氏定氮法紫外吸收法双缩脲法Folin-酚法考马斯亮蓝法,纯化的实质：增加制品的纯度或比活性。一般程序：（1）前处理（即提取）、（2）粗分级分离（3）细分级分离（4）浓缩与保存。,（二）蛋白质的分离纯化,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,盐析、等电点沉淀、有机溶剂分沉淀, 分离纯化蛋白质的主要方法：,根据蛋白质的溶解度分离沉淀技术； 根据电荷差异分离电泳技术； 根据分子大小分离分子筛层析及透析； 利用生物分子专一性结合的特性亲和层析； 选择性吸附分离吸附层析； 根据疏水性的差异。,（二）蛋白质的分离纯化,第五节
15、蛋白质的理化性质与分离纯化,透析 超滤,（二）蛋白质的分离纯化,沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。,密度梯度离心,又叫分子筛层析，分子排阻层析分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 具备条件：1.惰性，2.水不溶性，3.能高度水化。 常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）分离大蛋白质、小蛋白质，除盐型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶,凝胶层析,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,原理： 1. 分
16、子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,凝胶层析,2.小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。,阳离子交换树脂：强酸型和弱酸型(含-COOH)。处理成H+或Na+型，与阳离子交换。通常用阳离子交换树脂来分离氨基酸。 阴离子交换树脂：强碱型和弱碱型。上面结合的是阴离子，如Cl-和HO-，与阴离子交换。 层析装置及基本步骤：装柱，上样，洗脱，收集。洗脱剂(一定离子强度和PH的盐溶液);,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,离子交换层析,1.定义：利用蛋白质分子对其配体分子（或
17、配基）特有的识别能力，也即生物学亲合力，建立起来的一种有效的纯化方法。 2.配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，凝集素。配基先结合到琼脂糖等介质上作为固定相。 3.原理：先用不含配基的洗脱剂进行洗脱，将被分离蛋白质以外的杂志洗出来；然后用含配基的洗脱剂进行洗脱，将被分离的蛋白质洗出来。 4.常用方法：免疫亲和层析、金属螯和层析、染料配体层析,亲和层析,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,1.定义：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctroph
18、oresis) 。 2.几种重要的蛋白质电泳： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于Pr分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过Pr等电点的差异而分离Pr 双向凝胶电泳，是蛋白质组学研究的重要技术。,电泳技术,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,单 体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 增速剂：TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺) 引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素,？,加入SDS后蛋白质单体分子构象发生改变，形成的SDS蛋白质复合物的形状为长椭圆棒，迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量。,巯基乙醇破坏二硫键,等电聚焦（isoele
19、ctric focusing，IEF）,1.定义及原理：电泳的支持物预先制成pH梯度(蔗糖作介质），蛋白质混合物进行电泳时，各种蛋白质将聚焦于其等电点的pH梯度处，从而形成一明显区带。PI只有0.02个差异甚至小于0.02的差异就可以分离。可将人血清分成40多个区带。 2. pH梯度制作：采样两性电解质ampholyte,商品名为ampholine，是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和pI。在外电场作用下，自然形成pH梯度。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,特别适用于同工酶的鉴定 及用于蛋白质等电点的测定,等电聚焦电泳法测定蛋白质pI,双向电泳,1.定义及原理：第一向是等电聚焦，第二向是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2.特点：分辨率高，能分辩出3000种不同的蛋白质。成为蛋白质组学研究有力的技术手段。,第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化,双向电泳,
