1、-葡萄糖苷酶的研究来源： 添加时间：2011/2/24 13:43:00 -葡萄糖苷酶的研究 1837 年，Liebig 和 Wohler 首次在苦杏仁汁中发现了 -葡萄糖苷酶。 -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是 -glucosidase，属于水解酶类，又称 -D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的 -D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 -葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。-葡萄糖苷酶的研究 1837 年，Liebig 和 Wohler 首次在苦杏仁汁中发现了 -葡萄糖苷酶。 -葡萄
2、糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是 -glucosidase，属于水解酶类，又称 -D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的 -D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 -葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。- 葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛
3、平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；- 葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、 猪肝和猪小肠等。鉴于 -葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。1 -葡萄糖苷酶的分类 -葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为 3 类：第一类是能水解烃基 -葡萄糖苷或芳香基-葡萄糖苷的酶，此类 -葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-D- 葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基- 葡萄糖苷的酶，这类 -葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯 -D-葡萄糖苷等类似物。2 -葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 -葡萄糖苷酶的提取方
4、法 不同来源的 -葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH 值一般选用酶的稳定 pH 值；提取温度适于低温，一般为 4 。利用微生物发酵法生产 -葡萄糖苷酶是 -葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出 -葡萄糖苷酶。 2.2 -葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的 -葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。- 葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体
5、情况，采用多种方法逐步分离。目前分离 -葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如 DEAE 阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离 -葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离 -葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少。 2.3 -葡萄糖苷酶活性测定方法 -葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-D-葡萄糖苷(pNPG) 、纤维二糖、
6、水杨苷等。由于酶与 pNPG 作用产生的对硝基苯可用分光光度法在 400 nm 处测定， 方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用 pNPG 作为底物的分光光度法测定酶活性。由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。孙迎庆等用多种方法测 -葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定 -葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用 4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在 515 nm 下比色测定 -葡萄糖苷酶活性。 3 -葡萄糖苷酶的酶学性质 不同来源的 -葡
7、萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应 pH 值、pH 值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别（见表 1）。3.1 -葡萄糖苷酶的分子量大小 -葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。- 葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在 40250 kDa 之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构成。此外，有的菌株本身含有胞内和胞外 -葡萄糖苷酶，因此，有时来源于同一菌株的 -葡萄糖苷酶是两种不同分子量酶的混和物，甚至是多种不同分子量酶的混合物。 3.2 -葡萄糖苷酶最适 pH 值及 pI 值 目前很多的研究结果表明，- 葡
8、萄糖苷酶为酸性蛋白酶，其最适反应 pH 值一般在 3.07.0 范围内，其中许多酵母、细菌的胞内 -葡萄糖苷酶的最适反应 pH 值接近 6.0 左右；一般 -葡萄糖苷酶的 pH 值稳定性范围较广，在 pH 值 3.010.0 范围内，糖苷酶的稳定性较好。对大部分 -葡萄糖苷酶而言，它们的 pI 值都在酸性范围，并且变化不大，一般在 3.55.5 之间。如来源蜜蜂的 -葡萄糖苷酶，其 pI值接近 4.54.8 。 3.3 -葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性 -葡萄糖苷酶的最适反应温度为 40110 。一般来说，来自古细菌的 -葡萄糖苷酶其热稳定性和最适反应温度要高于普通微生物或动物来源的 -葡
9、萄糖苷酶。 3.4 -葡萄糖苷酶底物特异性 大多数的 -葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差，能裂解 C-O 糖苷键、C-S 键、C-N 键、C-F 键等；- 葡萄糖苷酶对底物糖基部分的 C4 和 C2 构形也不专一，能同时水解 -葡萄糖苷键和 -半乳糖苷键，有些甚至 C6 位的专一性也不高，能水解木糖。在很多底物中，-葡萄糖苷酶对纤维二糖和人工合成的底物对硝基苯-D-葡萄糖苷(pNPG) 表现出较高的酶活性。此外，也有一些 -葡萄糖苷酶对底物表现出很强的专一性。Franck E. Dayan 等(2003) 从 Podophyllum peltatum 的叶子中提取的 -葡萄糖苷酶对足
10、叶草毒素-D-葡萄糖苷（podophyllotoxin-4-O-D-glucopyranoside）有很高的专一性，对烃基-葡萄糖苷（如寡糖、纤维二糖、纤维三糖等）的水解作用较小，对芳香基-葡萄糖苷根本没有水解作用。 3.5 金属离子及化合物对 -葡萄糖苷酶的影响 许多 -葡萄糖苷酶的酶学性质研究都表明，葡萄糖是 -葡萄糖苷酶的典型抑制剂。 Hg2+、Cu2+和 Ag+对大部分酶抑制作用较明显， SDS(十二烷基磺酸钠)及脲对酶也有不同程度的抑制作用。但 Mn2+ 和 Co2+对该酶有明显的激活作用。4 -葡萄糖苷酶的结构及催化机理 4.1 -葡萄糖苷酶的结构 按糖苷酶的氨基酸序列分，大多数
11、-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族 1，糖苷酶族 1 有明显的桶状结构。但是，也有一些 -葡萄糖苷酶属于糖苷酶族 4，属于糖苷酶族 4 的 -葡萄糖苷酶往往要求在催化过程中有脱氢酶和辅助因子参与，有文献报道，6-磷酸-D-葡萄糖苷酶在催化过程中需要 Mn2+和辅酶 NAD+的参与。 4.2 -葡萄糖苷酶的活性中心结构 有研究表明，-葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸残基。采用定点突变的方法证明，靠近 N-端的谷氨酸是酸碱基团，另外一个是亲核基团。 4.3 -葡萄糖苷酶的催化机理 对分别来自 Agrobacterium 和 Pyrococcus furiosus 的 -葡萄糖苷酶进行研究发现，两种来
12、源的 -葡萄糖苷酶在催化反应时是按同一种反应机制进行的，即在催化水解糖苷键反应时都遵循双取代反应机制（Double Displacement Mechanism）。其反应方程式如下：在催化反应中，需要两个重要的氨基酸残基作为质子供体（Proton donor）和亲核基团（Nucleophile）。水解反应的基本过程可以分为3 步：第一步是酶与底物键合形成米氏复合物 ES；第二步是酶的亲核基团在酸碱催化（提供一个质子）帮助下，去攻击底物的糖苷键O 原子，形成共价的糖基酶中间体 E-S，在这个过程中，-葡萄糖苷酶的活性中心可以根据不同类型的底物而相应发生一定程度的结构变化，使 -葡萄糖苷酶可以和多
13、种糖类底物结合，这一步决定了 -葡萄糖苷酶具有的底物专一性；第三步是酶底物过渡态的水解，酸或碱基团催化一个水分子攻击中间体 E-S，与之反应，以切断糖苷键，释放 -糖基产物，并使酶恢复其初始的质子化态。 以上三步反应基本上可以解释 -葡萄糖苷酶的催化机理。但是不同族的 -葡萄糖苷酶在反应机理上又稍微有所不同，如糖苷酶族 4，该族糖苷酶的催化反应过程需要二价金属离子和 NAD+的参与，脱氢酶 NAD(H)和底物通过与 Mn2+的共价结合，三者形成“V”字形。底物在脱氢酶的作用下变成酮式结构，接着在酸催化和碱催化的作用下，酶与底物形成中间过渡态。最后由水分子攻击糖基酶中间体中糖基上的双键，同时底物酮式结构消失，-糖基产物得到释放，此外 NAD+得到再生。5 应用及展望 目前对 -葡萄糖苷酶的理化性质研究得比较透彻，但是对它的应用开发研究力度还是不够。在饲料工业上，- 葡萄糖苷酶通过破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。此外，在食品开发上，其作为特殊的风味酶已得到应用，如李平等将黑曲霉 -葡萄糖苷酶应用在果汁、茶汁、果酒等制备上，能起到较好的增香效果。
