病毒感染细胞筛选.doc

1、细胞筛选 一 嘌呤霉素 (一) 确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在 2-10 微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。 （筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的 70%80%时） ，用新鲜无抗无血清的培养基制成 1.5105 个/ml 的细胞悬液。 3. 向 96 孔培养板中加细胞悬液，每孔 100 微升（使每孔细胞数在 1.5104 个） ，然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静

2、置培养过夜。 （这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418 药物筛选浓度。 ） 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为 0, 2, 4, 6, 8, 10 微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。 （每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次） 。 （注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。 ） 5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天) 更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天） 。 6. 在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间

3、而定，大概需 3 到 14 天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在 3-5 天内杀死所有细胞的浓度。 (二) 转染细胞 1. 第一天：在 60mm 培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到 70%-80%的密度，CO2 孵箱过夜培养。 2. 第二天：准备 3ml 无抗生素无血清培养基，加入 Polybrene 使其终浓度为 8g/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5 ml 加至上述培养基，轻吹混匀。去除 60mm 培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。 （Polybrene 能够增加病毒感染的效率，然而，有时候 Poly

4、brene 对细胞有毒性。这时，可以用 Protamine Sulfate 代替 Polybrene） (三) 筛选细胞 1. 病毒感染后 24 小时，可以换用含最优浓度 puromycin 的培养基。 2. 如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至 4-6 小时，然后换用新鲜培养基，24-48 小时后换加含最优浓度 puromycin 的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入 Ploybrene，观察Polybrene 是否对细胞有毒性；如果 Polybrene 没有毒性，还可以加入 puromycin，作为puromycin 是否有效的对照。 3. 以后每隔一天换用新鲜含 purom

5、ycin 的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后 10 到 12 天） 。 4. 待抗性细胞长满以后，细胞转入 10cm 培养皿，同时，留一部分细胞在原来的 60mm 平皿内。 5. 60mm 平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或 mRNA 水平鉴定基因敲低效率。6. 10cm 培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存 4-5 支细胞，待基因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过 5-6 次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可

6、以移至普通细胞培养室内培养研究。 二 G418 (一) 确定最优筛选浓度 由于每种细胞对 G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的 G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定 G418 的最佳筛选浓度。 1. G418 的配制： 取 1g G418 溶于 1ml 1mol/L 的 HEPES 液，加蒸馏水定容至 10ml（使G418 终浓度为0.1g/ml ,HEPES 终浓度为 100mmol/L） ，过滤消毒，4 度保存。 HEPES 的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N -ethanesulfanic acid ）

7、 ，分子量 238.31，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的 pH处于恒定的范围，而对细胞无毒性作用。 1mol/L HEPES 的简单配置：HEPES 2383g，溶解于 80ml 的双蒸水中，用 10mol/L 的NaOH 调节 pH 至wk_ad_begin(pid : 21);wk_ad_after(21, function()$(.ad-hidden).hide();, function()$(.ad-hidden).show();); 7.2-7.4，定容至 100ml，0.22um 小滤器过滤。HEPES 使用终浓度为 10-50mmol/L。 2. 制备筛选培养基：在

8、100ug/ml1000ug/ml 范围内按0ug/ml 、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml 浓度用无抗无血清培养基稀释 G418 制成筛选培养基。心得：由于特性明确的细胞系 G418 的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染 NIH3T3 细胞 ，现在我告诉你我测试过 NIH3T3 细胞对 G418 的敏感性，我用的筛选浓度是 200 ug/ml。这时你就可以做 150ug/ml、200ug/ml、 300

9、ug/ml 三个浓度进行筛选。 3. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。 （筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 4. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的 70%80%时） ，用新鲜无抗无血清的培养基制成 1104 个/ml 的细胞悬液。 5. 向 96 孔培养板中加细胞悬液，每孔 100 微升（使每孔细胞数在 1103 个） ，然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养。 （这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳 G418药物筛选浓度。 ） 汇合度：实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们 100%汇合，也就是汇合度 100%。汇合度对 G

10、418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过 50% ！ 6. 培养 6 小时左右开始加药。加筛选培养基筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS 洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基适量。 7. 换液： 每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天( 即每隔两天) 更换筛选培养基一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天） 。有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。 8. 确定最佳筛选浓度：在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，在筛选 1014 天内能够杀死所有细胞的最小 G418 浓度即为最佳筛选浓度。 在第一轮就筛选

11、出最佳 G418 浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度 G418 的量在筛选 14 天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418 的量在 10 天前就看不到活细胞了。假如是 400ug/ml 不能杀死细胞，而 800ug/ml 在第 5 天就把所有细胞都杀死了，则可以再用 500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml 进一步筛选，以确定最佳筛选浓度。(二) 转染细胞 1. 第一天：在 60mm 培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到 70%-80%的密度，CO2 孵箱过夜培养。 2. 第二天：准备 3ml 无抗生素无血清培养基，加入 Polybrene

12、，终浓度为 8g/ml。将已经制备的病毒颗粒 0.5 ml 加至上述培养基，轻吹混匀。去除 60mm 培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene 能够增加病毒感染的效率，然而，有时候 Polybrene 对细胞有毒性。这时，可以用 Protamine Sulfate 代替 Polybrene） 3. 转染后培养 24 小时或者更长，到细胞增长接近70汇合时按 1：4 密度传代，继续培养，待细胞密度增至5070汇合时开始筛选。 (三) 筛选细胞 1. 加 G418：去掉培养液，PBS 洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的 G418 筛选培养基（无抗无血清）( 实际应用时可以比最佳

13、筛选浓度高一级别)。 2. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每 35 天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418 浓度减半维持筛选。 筛选 1014 天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。 3. 待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到 1 个/10ul。在 96 孔板中加入培养基 150ul/孔，再加入细胞悬液 10ul/孔。待其逐渐增大后转入到 48 孔中增殖。 4.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总 RNA，做 RT-PCR 检测目的基因是否存在。 典型贴壁细胞平板密度 培养板大小 生长面积（cm2） 大约细胞数 培养基容积（

14、ml） 组织培养皿（60mm） 28 66105 5-6 6 孔培养板（35mm ） 9.5 3105 1-2 12 孔培养板 22.6mm） 4 13105 05-1 24 孔培养板（8mm ） 05 06105 025-05 慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4 保存；如需长期保存请放置于-80（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） 病毒可以存放于-80 6 个月以上；但如果病毒储存时间超过 6 个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度 10%；因此

15、在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用 PBS 或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后 4保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数

16、（MOI 值） （使用 24 孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） 。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela ）作为平行实验的对照细胞。 在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 一般慢病毒单位为 TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有 1X108 个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以 24 孔培养板

17、为例，进行目的细胞和 HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的 MOI 设置不同的感染孔，并根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用 PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在 24 孔培养板接种若干孔，每个孔内接种 35X104 个目的细胞，铺板时细胞的融合率为 50%左右，每孔培养基体积为 100 l；进行病毒感染时细胞的融合度约为 70%左右。 第二天，准备病毒：取出 4保存的病毒，使用台式离心机离心 20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可） ；如果是冻存在-80的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照 MOI 准确

18、计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含wk_ad_begin(pid : 21);wk_ad_after(21, function()$(.ad-hidden).hide();, function()$(.ad-hidden).show();); 有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。 第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验。 a 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。 b 吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液） 。c 在目的细胞和对照细胞中分别加入

19、计算好的病毒液。 d 混匀后放于二氧化碳培养箱（37、5%CO2 ）孵育过夜。 注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中。慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高 MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是当 MOI 高于 20 时，我们建议在培养基中加入 ploybrene（8 g/ml 左右）来提高病毒的感染效率。 第三天，更换培养液：一般在 24 小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在

20、加病毒 4 小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在 8-12 小时更换为宜） 。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。 第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带 Marker Gene 的，可以通过 Real-timeRT-PCR 检测目的基因的表达来拍评估感染效率。 注意： 有些慢病毒载体上带有 GFP 绿色荧光蛋白，使用者可以在病毒感染 96 小时后用倒置荧光显微镜观察 GFP 绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。如果慢病毒载体携带其他 Marker Gene 如 R

21、FPBFP 可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后 96 小时后观测荧光表达。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。 三、慢病毒使用安全使用规范 慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，不建议使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。使用时请参照如下所示进行实验： 1病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。 2病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。