1、ICS 65.020.30B41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T 3128.12018I 群禽腺病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒分离鉴定Diagnostic techniques for Fowl Adenovirus Group I infectionPart 1：Isolation and identification of FAdV group I2018 - 02 - 02 发布 2018 - 03 - 02 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/T 3128.12018I前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东
2、省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、窦砚国、郑肖强。DB37/T 3128.120181I 群禽腺病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒分离鉴定1 范围本标准规定了I群禽腺病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。本标准中I群禽腺病毒分离与鉴定技术适用于I群禽腺病毒中12种血清型病毒的分离鉴定、间接免疫荧光试验（IFA）适用于上述病毒的检测、限制性片段长度多态性分析（RFLP）适用于对I群禽腺病毒12种血清型病毒的鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用
3、文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫3 术语和定义下列定义和术语适用于本文件。3.1 I群禽腺病毒 Fowl adenovirus group I是引起家禽包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征的病原，基于交叉中和试验结果，该病毒可分为12种血清型。3.2 间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA）用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵
4、育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光信号为阳性反应。3.3 限制性片段长度多态性分析 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，用于检测DNA序列多态性。3.4 LMH细胞DB37/T 3128.120182鸡胚肝癌上皮细胞系，来源于雄性鸡肝脏肿瘤。4 实验室质量控制4.1 实验室符合 GB19489 和 GB/T 27401 要求，实验室必须为生物安
5、全级（BSL-2 级）及以上实验室。4.1.1 操作中注意事项4.1.1.1 从事 PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。4.1.1.2 特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。4.1.1.3 病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原则，避免交叉污染。4.1.2 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的 EB 可诱发基因突变，试验中被 EB 污染的物品要有专用收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。4.1.3 生物
6、样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。4.2 人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。4.3 仪器设备a) 生物安全柜；b) PCR 仪；c) CO2恒温培养箱（37恒温）；d) 台式低温高速离心机（最大转速 12000r/min）；e) 电泳仪；f) 电泳槽；g) 紫外凝胶成像仪；h) 2C8C 冰箱；i) - 20C 冰柜；j) 微量移液器（最大量程分别为 10L、20L、100L、1000 L），带滤芯的枪
7、头；k) 孵化器（37恒温）；l) 水平摇床；m) 电子天平精度为：0.001g；n) 电磁炉或微波炉；o) 荧光倒置显微镜（FITC）。4.4 试剂和材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。a) 磷酸盐缓冲液（pH=7.07.4），见 A.1；b) 细胞培养液（含 10%血清的 DMEM 培养基）；c) 细胞维持液（含 1%血清的 DMEM 培养基）；DB37/T 3128.120183d) 甲醇：丙酮（1:1）固定液；e) 抗体稀释液 PBST，见 A.2；f) 商品化的 FITC 标记鼠抗兔荧光抗体；g) 兔抗 I 群禽腺病毒多克隆抗体（灭活疫苗免疫兔制备）；h) 50 %甘油；i)
8、商品化的 DNA 提取试剂盒；j) rTaq DNA 聚合酶(5 U/L)；k) 10PCR Buffer；l) dNTPs（2.5 mmol/L）；m) 商品化的 DNA 分子量标准，要求在 100 bp2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带；n) 1.5 %琼脂糖凝胶，见 B.1；o) 1TAE 缓冲液，见 B.2；p) 溴化乙锭（10g/L），见 B.3；q) 核酸电泳加样缓冲液，见 B.4；r) 商品化核酸凝胶纯化试剂盒；s) DNA 限制性内切酶 Hae II；t) 阳性对照标准品，I 群禽腺病毒细胞培养物；u) 阴性对照标准品，高压灭菌的蒸馏水；v) 本标准中使用的水均按照
9、 GB/T6682 制备和使用；w) SPF 鸡胚；x) LMH 细胞；y) Hexon 基因扩增引物。FAV-AF：5-TGGACATGGGGGCGACCTA-3；FAV-AR：5-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3，扩增片段 A 长度约为 1210 bp；FAV-BF：5-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3 ；FAV-BR：5-TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3，扩增片段 B 长度约为 1350 bp。上述引物浓度均为 50mol/L。5 样品采集与处理5.1 样品采集采集疑似群禽腺病毒感染死亡家禽肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理；活禽采集泄
10、殖腔拭子。样品置于密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4，时间不超过24h。5.2 样品保存5.2.1 室温条件下样品在 1 h2 h 内处理完毕，未能及时处理的样本在 4 冰箱中存放，不超过 24 h；也可于-20 低温条件下保存，不超过 30 d；-70 贮存最佳，不超过 1 年。5.2.2 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20 低温条件下保存，不超过 2 周；-70贮存不超过 30 d。5.3 样品处理5.3.1 在生物安全柜中，取 10 g20 g 样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。DB37/T 3128.1201845.3.2 用含有抗生素（青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(
11、2 mg/mL)、庆大霉素（50g/mL）和制霉菌素(1000 IU/mL)等渗磷酸盐缓冲液（PBS，pH 值 7.07.4，附录 A.1）配成 10 %20 % (g/mL)的悬液；泄殖腔拭子悬液中抗生素浓度提高 5 倍。加入抗生素后 pH 调至 7.07.4。5.3.3 5.3.3 样本组织悬液反复冻融 3 次，经 8000 r/min 离心 10 min，取上清并置 4过夜，次日接种 SPF 鸡胚或 LMH 细胞系。6 病毒分离6.1 鸡胚接种6.1.1 将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种（3 枚5 枚）9 日龄11 日龄 SPF 鸡胚， 0.2 mL/胚，置于孵化器中，37 孵化 12
12、0 h。6.1.2 弃去 24 h 内死亡胚，24 h120 h 内死亡和存活鸡胚置 4 冰箱过夜或-20 冷冻 1 h，分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。6.2 细胞接种6.2.1 将处理后的样品上清接种单层 LMH 细胞，孵育 1 h，吸弃上清，用 PBS 缓冲液轻轻洗涤 2 次，吸弃后加入细胞维持液。6.2.2 70 %以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至冻存管置于-70 保存，不超过 3 年。7 病毒鉴定7.1 间接免疫荧光法（IFA）7.1.1 细胞固定将接种病毒48 h的LMH细胞培养板用PBS缓冲液轻轻洗涤3次4次，吸弃液体。每孔加入用-20
13、 预冷的甲醇：丙酮（1:1）固定液150L，置于-20 孵育10 min，吸弃固定液。干燥后用PBS缓冲液洗涤3次。7.1.2 一抗孵育用抗体稀释液（PBST，见附录A.2）将兔抗I群禽腺病毒多克隆抗体作1:200倍稀释，每孔加入100L，置于湿盒中，37 孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3次。7.1.3 二抗孵育避光条件下，用PBST将FITC标记鼠抗兔抗体作1:200倍稀释，每孔加入100L，置于湿盒中，37 孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3 次。7.1.4 封片观察加入数滴50 %甘油（附录A.3）封片，置于荧光倒置荧光显微镜（FITC荧光目镜）下，观察是否出现绿色荧光信号。7.2 限制性
14、片段长度多态性(RFLP)分析DB37/T 3128.1201857.2.1 DNA 的提取按照商品化DNA提取试剂盒说明书提取病毒细胞培养物中的总DNA，以此为模板分别扩增Hexon基因的片段A和B。7.2.2 PCR 反应体系10PCR Buffer 2.5 L， dNTPs（2.5 mmol/L）2 L，上游引物（50 mol/L）和下游引物（50 mol/L）各0.5 L，DNA模板3L，rTaq DNA聚合酶0.25 L，加ddH2O至25 L。7.2.3 PCR 反应条件94 C预变性5 min；94 30 s，50 30 s，72 2 min，进行30个循环；72 延伸10min
15、。7.2.4 琼脂糖凝胶电泳分别取18 L PCR产物（片段A和片段B）与2 L核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳20 min40 min，每隔10 min观察一次。7.2.5 琼脂糖凝胶电泳成像当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，停止电泳。将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下观察。7.2.6 PCR 产物纯化按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对阳性条带回收、纯化，溶解于30L ddH2O中。测定核酸浓度，确保核酸浓度10ng/L。7.2.7 分子克隆测序将纯化的核酸片段进行常规分子克隆、测序，获得的
16、Hexon基因中片段A和片段B的序列。7.2.8 限制性内切酶酶切反应体系：PCR产物（片段A或B）17L、10缓冲液2L、Hae限制性内切酶1L，总体积为20L。反应条件：37 孵育1 h，72 作用5 min。7.2.9 酶切产物电泳取酶切产物9L，按照7.2.4的步骤进行琼脂糖凝胶电泳。7.2.10 序列酶切位点分析用在线软件NEB cutter2.0分析片段A和片段B中的Hae限制性酶切位点。7.2.11 对照设置每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品（LMH细胞），至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳性对照。8 结果判定DB37/T 3128.1201868.1 LMH 细
17、胞感染 I 群禽腺病毒，细胞肿胀变圆，呈葡萄串状，细胞间隙增大，IFA 检测出现绿色荧光信号。在阳性对照出现绿色荧光信号，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时，检测样品阳性的表明样品中存在 I 群禽腺病毒，阴性样品中无 I 群禽腺病毒。8.2 阳性对照接种细胞出现细胞病变，IFA 检测显示胞浆出现绿色荧光信号（附录 C），阴性对照无细胞病变，胞浆未出现绿色荧光信号时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，阳性样品用于病毒的血清型鉴定。8.3 以阳性样品培养物的总 DNA 为模板，PCR 扩增 Hexon 基因的片段 A 和 B，经限制性酶切多态性分析，与 I 群禽腺病毒血清分型标准酶切图谱（附录 D）比对，确定阳性毒株的血清型。DB37/T 3128.120187A A附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制A.1 PBS溶液的配制：体系组成 含量NaCl 3.9 gNa2HPO412H2O 0.2 gKH2PO4 0.2 g双蒸馏水加至 1000 mLA.2 PBST溶液的配制：体系组成 含量NaCl 3.9 gNa2HPO412H2O 0.2 gKH2PO4 0.2 g吐温-20 0.5 mL双蒸馏水加至 1000 mLA.3 50 %甘油体系组成 含量甘油 50 mL蒸馏水加至 100 mL
