实用流式细胞图.pdf

1、 1第一章 流式细胞仪的结构和原理 第 1 节 流式细胞术发展史 纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为： 流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际

2、应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪； 对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测 15 种荧光信号； 从检测参数的相对定量发展为绝对定量； 从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析； 所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识， 只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。 流式细胞术的发展简史： 1930 年 Caspersson 和 Thorell 开始致力于细胞的计数； 1934 年

3、 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人， 他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞数量； 1936 年 Caspersson 等引入显微光度术； 1940 年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白； 1947 年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器； 1949 年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利； 1950 年 Caspersson 用显微分光光度计的方法在紫外线（ UV）和可见光光谱区检测细胞： 1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器； 19

4、53 年 Parker和 Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形； 1954 年 Beirne 和 Hutcheon 发明光电粒子计数器； 1959 年 B型 Coulter 计数器问世； 1965 年 Kamemtsky 等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对细胞分类； 1967 年 Kamemtsky 和 Melamed 在 Moldaven 的方法基础上提出细胞分选的方法； 1969 年 Van Dilla，Fulw yler 及其同事们在 Los Alamos，NM( 即现在的 National Flow Cytometry Resource

5、 Labs),发明第一台荧光检测细胞计； 1972 年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号； 1975 年 Kochler和 Milstein 提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。 从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入 21 世纪，流式细胞术作为一门生2物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。 第 2

6、 节 流式细胞仪结构和工作原理 流式细胞仪（ Flow cytometry ,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、 快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各项相关技术的迅速发展， FCM 技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。 流式细胞仪分为三大类： 一类为台式机，临床型，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，见图 1-2-1。 图 1-

7、2-1 临床型台式流式细胞仪 （左： BD FACSCalibur 2L， 4F； 右： Coulter EPICS XL/XL-MCL 1L， 4F 中： Partec， cyFlow 1L,3F） 第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上， 同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图 1-2-2、 1-2-3。 3图 1-2-2 大型科研型流式细胞仪 （左： BD， FACSDiVa 14F， four-sorting； 右： Coulter EPICS ALTRA4

8、L,8F； 中： Partec， CyFlow SPACE 2L， 6F） 第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用 2-4 根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到 15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到 50,000 个 /秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。 图 1-2-3 目前最新型流式细胞仪 （左上： partec， CyFlow ML FSC,2xSSC,FL1FL13；右上： Coulter， CytomicsTM FC 500 左下： FACSAria， FSC， SSC， FL1-FL13； 右下： BD， BD L

9、SR， 4L， 10F） 4（一） 流式细胞仪的结构 FCM 的结构一般分为 5 部分： 流动室及液流驱动系统； 激光光源及光束成形系统； 光学系统； 信号检测、存贮、显示、分析系统； 细胞分选系统。见图 1-2-4。 图 1-2-4 流式细胞仪的光路结构 1、流动室与液流驱动系统 流动室（ Flow Chamber 或 Flow Cell）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为 430 180m 的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透

10、镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息，见图 1-2-5。 图 1-2-5 FCM 的流动室和液流系统 细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从 Bernoulli 方程，即 P=(1/2)PV（勿略高度的变化） ，可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。 从图 1-2-5 可以知道，真

11、空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一恒定的压力（压力的大小由工厂设定） ，这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样5本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流经光照射区的细胞数就增加。 这种情况应在具体实验中引起注意， 由于激光焦点处能量分布为正态分布 （见图 1-2-5） ，中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（ Hi）时，处在样品流不同位置的细胞或颗粒，受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测量误差。当在测量分辨率要求高

12、时（如 DNA 分析）应选取用低速（ Low） 。 2、激光光源与光束成形系统 目前台式机 FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光（ light amplification by stimulated emission of radiation , Laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为 1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为

13、22 66m 即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图 1-2-6） 。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机 FCM 的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作任何调节，所以使用者操作十分方便。 3、光学系统 FCM 的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器（见图 1-2-6） 。 在 FCM 的光学系统中主要光学原件是滤光片（ Filter） ，主要分成 3 类：长通滤片（ long-pass filter, LP） 、短通滤片

14、（ short-pass filtr, SP）及带通滤片（ band-pass filter, BP） 。 （ 1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如 LP500滤片，将允许 500m 以上的光通过，而 500m以下的光吸收或返回。 （ 2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。如 SP500 滤片，将允许 500m以下的光通过，而 500m 以上的光吸收或返回。 （ 3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如 BP500 表示其允许

15、通过波长范围为 475m -525m。 图 1-2-6 流式细胞仪的光学系统 64、信号检测与分析系统 当细胞携带荧光素标记物， 通过激光照射区时， 受激光激发， 产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360 度立体角发射，产生散射光和荧光信号。 （1）散射光信号： 散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（side scatter,SSC） ，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色） ，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数（见图 1-2-7） 。 前向角散射： 前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切

16、相关，通常在 FCM 应用中，选取 FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 侧向角散射： 侧向角散射是指与激光束正交 90o方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。 图 1-2-7 流式细胞仪的散射光图 （ 2）荧光信号： 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两

17、种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下， 发出微弱荧光信号， 称为细胞自发荧光； 另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量 (图 1-2-8)。 图 1-2-8 激光的作用原理 前向角散射 侧向角散射激光 FreqFl激光 7荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。 选取染料或单抗所标记的荧光素， 必须考虑仪器所配置光源的波长。 目前台式机 FCM常配置的激光器波长为 488nm，通常可采用的染料有碘化丙锭 (propidium iodide， PI)、藻红蛋白

18、(phycoerythrin， PE)、异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate， FITC） 、 PE-CY5 等。 荧光信号的线性测量与对数测量 荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（ PMT） ， PMT 将光信号转换成电信号。有些厂家不采用 PMT，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降低，最高速度不可能超过 3 300 个细胞 /秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此

19、高档仪器不采用此种方法。 电信号输入到放大器放大， 放大器分两类： 线性放大和对数放大。线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞 DNA 含量、 RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。 但在细胞膜表面抗原等的检测时， 通常使用对数放大器，如果原来输出是 1，当输入增大到原来的十倍时，输出为 2；当输入增大到原来的 100 倍时，输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。 荧光信号的面积和宽度 所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对 DNA 含

20、量测量时，采用面积 (FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA 的含量，当形状差异较大，而 DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。 荧光信号的宽度（如 FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于 DNA 样本极易聚集，当两个 G1期细胞粘连在一起时，其测量到的 DNA 荧光信号（ FL2-A）与 G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据 G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设 ”门 ”（ gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（ FL2-W）要比单个 G2M 细胞

21、大，因此设 ”门 ”后才能得到真正的 DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。 光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光素（如 PE 和 FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种荧光间相互干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，

22、作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保光源程序间互不干扰。因此可以避免有第 1 激光（ 488nm）激发出的 FL1、 FL2、 FL3 和第 2 激光（ 635nm）激发出的 FL4 间的补偿。当然， FL1、 FL2 和 FL3是来自同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。 5、 FCM 测量数据的存贮、显示和分析 目前 FCM 数据的存贮的方式均采用列表排队（ list mode）方式。因为目前 FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是 4 个，采用 list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测 4 个参数，那么获取 10000 个细胞，所占容量为

23、4 10000 个（字或双字） 。同时当只检测 1 个参数时（如 DNA） ，可灵活的关闭其它 3 个参数，节省 3/4 的空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直8方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。 （ 1）单参数直方图： 细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布， 以分布直方图 （ distribution histogram）来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图 1-2-9。 图 1-2-9 DNA 含量直方图和抗原表达直方图 左图较低道数处细

24、胞峰为 G1期细胞，道数为 G1期细胞两倍的是 G2M 期细胞，二者之间是 S 期细胞。右图 100-101（ M1）为阴性细胞，而 101以上（ M2）为阳性细胞。 （ 2）双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系， 常用的表达方法有二维点图（ dot plot） ,等高线图（ contour plot） ,二维密度图（ density plot） 。在二维图中，X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而 Y 坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为 FSC 和 SSC 组成的点图，从图中可以

25、很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据。右下图是通过设门分析（ gating analysis）得到的FL1 和 FL2 散点图，设门可以是单参数设门 ，也可以是双参数设门 ，通过设 ”门 ”可以调出其它参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图 1-2-10(左 )就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图，设 ”门 ”圈出标本中的淋巴细胞群体，再调出免疫荧光的散点图图 1-2-10（右） 。 散射光图 双色标记荧光图 图 1-2-10 双参数免疫荧光点阵图 （二）流式细胞仪的主要技术指标 91、荧光测量灵敏度： 灵敏

26、度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以能检测到单个微球上最少标有 FITC 或 PE 荧光分子数目来表示，一般现在 FCM 均可达到600 个荧光分子。 2、仪器的分辨率： 分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数 CV（ coeffeient of variation）值来表示： CV=d/m100%(d-是分布的标准误差， m-是分布的平均值 ) 如果一群含量完全相等样本，用 FCM 来测量，理想的情况下， CV=0，用 FCM 测量曲线表示为图 1-2-11（左） ，但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的误差，样本在进入流动室时照射光的微弱变化，再加

27、上仪器本身的误差等，实际得到的曲线为图 1-2-11（右） 。 图 1-2-11 仪器分辨率的显示 CV 值 CV 值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小。一般的 FCM 在最佳状态时 CV值 2%。 CD 值的计算，除采用以上计算公式外，还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽， m 代表峰顶部的荧光道数；它们与 CV 值的的关系式如下： CV=半高峰宽 /m 0.4236 100% 上述公式是建立在正态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形，故采用半高峰宽所计算得到的 CV 值要明显小于前公式得到的 CV 值，这在实际工作中应引起注意。 3、前向角散

28、射光检测灵敏度： 前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的 FCM 可以测量到 0.2-0.5 m 左右。 4、 FCM 分析速度： 分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过 FCM 仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间（ dead time） 。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达 3 000 个 /s-6 000 个 /s，大型机已达每秒几万个细胞。 5、 FCM 分选指标： 分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选速度为

29、300 个 /s，大型机的 FCM 最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到 99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低；反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或舍的决定。因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。图 1-2-12 为两种细胞分选原理示意图。 10图 1-2-12 细胞分选示意图 （ 左：通道式分选； 右：电荷式分

30、选 ） (三 ) 流式细胞仪补偿设置 众所周知，流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将 488nm或其他波长的光转变为另一波长的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算机统计处理变为可读数据。 现在流式细胞上常用的荧光素有： 激发波长 发射波长 FITC 488nm 525nm PE 488nm 575nm PE-TR 488nm 615nm PE-Cy5.5 488nm 667nm PE-Cy7 488nm 767nm （以上五种荧光染料可在 Coulter XL 或 BD Calibur 或 Partec,PAS,Cyflow， Cytomation,Mof

31、lo机型上使用） APC 633nm 660nm APC-Cy 633nm 767nm (以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如 Coulter,Altra 或 BD Calibur 或 Partec Cyflow ML 或 Cytomation, Moflow) 以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值， 但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为 FTIC， PE 的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布， FITC 受激后多数将光源转变为 525nm 左右的光； PE 多数将其转变为 575nm 左右的光。故在流式细胞仪中对 FITC 检测

32、 525nm 附近的光，对 PE 则检测 575nm11左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。 图 1-2-13 受激光照射后 FITC 和 PE 分子发射光谱互相干扰图 根据上图中 FITC 和 PE 发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时， PE 荧光探测器便会误检由 FITC 发射的 575 左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入 PE 荧光信号中，从而引起错误。同样 PE 受激后也会发出小部分 525nm 左右的光，进入 FITC 荧光探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。 现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的 FIT

33、C、 PE 等荧光分子性状十分相近，其发射光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以百分比后的数值。如图： 图 1-2-14 FITC 无 PE 荧光检测补偿调节示意图 图 1-2-15 PE 无 FITC 荧光检测补偿调节示意图 12其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做 FITC、 PE、 PE-Cy5 三色荧光分析原则上需要调节的补偿有： FITC-%PE， PE-%FITC， PE-Cy5-%FITC， PE-Cy5-%PE， FITC-% PE-Cy5，PE-% PE-

34、Cy5 六组补偿，即有 23种组合。 由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以 525nm 或其他波长的光信号可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿过程中的百分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达到的效果是：漏进其他探测器的信号 -原荧光探测器的信号 x N%=0。由此补偿的百分比数值将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。 要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。如现进行 FITC、 PE 双色分析，先准备该试剂的阴性对照管： A： I

35、gGFITC/IgGPE，通过调节电压，使阴性群体落在 FTIC 及 PE 双阴性区。 （注：在进行调补偿时，必须将原补偿全部归零） 图 1-2-16 PE 和 FITC 分子的阴性对照 阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。当荧光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号） ，和特异性结合信号。 所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围

36、。 B： FITC 标记抗体 /IgG-PE 13图 1-2-17 未调补偿的双参数直方图 上图为未调补偿的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰） ，因为检测管中只含有 PE 标记的 IgG 阴性对照（如同 A 管一样） ，所以仍将没有何任信号出现。但实际情况并不如此，在 PE 坐标上出现了阳性信号。这个信号就是由于 FITC 荧光漏入 PE 探测器中而引起的。此时就要取一合适百分比与 FITC 信号相乘后去抵消 PE 中的信号。 （此时电压已通过阴性对照设定，绝对不可变动！ ） 通过调节补偿参数如下图： 图 1-2-18 A 管 FITC 荧光信号补偿的调节 打个比方，通过 A 管已将

37、 FITC、 PE 的荧光信号设为零；此时检测 FITC 标记抗体与 PE阴性对照， FITC 信号假设为 1000，漏入 PE 的信号为 200。在补偿调节 1 号位时，补偿数字为 5%，通过计算得出 PE 信号： 200-1000x5%=150；此时 1 号位的补偿不足。同理 2 号位的补为 15%，此时 PE 信号为： 200-1000x15%=50；补偿仍显不足。 3 号位的补偿为 20%，PE 信号为： 200-1000x20%=0，补偿调节良好。 4 号位补偿为 30%， PE 信号为：200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头， PE 的信号会比原来的本底还低。补偿调节不

38、足或过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出现。 当将 FITC 漏入 PE 的信号恰好全部减除时，即 PE 信号与原来本底相同时，此时的补偿便是正确的；即 FITC 单阳性细胞的 PE 的平均荧光强度与双阴性细胞 PE 荧光强度一致。 图 1-2-19 FITC/PE 双阴和 FITC 单阳荧光示意图 对于 FITC 阳性细胞，通过调节补偿需将 PE 中的信号恢复至与其本底一至。由上图可知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过 A 管调节电压确定阴性范围。其次，在检测 FITC 标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将 PE14的信号降至与本底一至

39、而不会过多或过少地调节补偿。 同理，如检测 C 管： FITC 阴性对照 /PE 标记抗体，可将 PE 漏入 FITC 中荧光去除。但前提条件是在 C 管中要存在 FITC/PE 双阴性细胞和 PE 单阳性细胞。 图 1-2-20 FITC/PE 双阴和 PE 单阳荧光示意图 在流式细胞上， 当 PE 单阳性细胞的 FITC 平均荧光强度与双阴性细胞的 FITC 平均荧光强度一致时，补偿便调节完毕。 在做多色分析时， 必须做荧光之间的补偿。 方法如上， 先准备各种标记的荧光阴性对照，调节确定合适的放大电压。逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。

40、在日常工作中，我们可以用 CD4/CD8，或 CD3/CD4/CD8 多色抗体来调节荧光补偿。现将其原理及方法解释如下。 在人外周血中，存在有 T、 B、 NK 等白细胞。当加入 CD3-PE-Cy5/CD4-FITC/CD8-PE三色荧光抗体时，会出现以下几种情况： CD3-/CD4-/CD8-细胞群：如 B 细胞 CD3+/CD4-/CD8-细胞群：如 NK 细胞 CD3+/CD4+/CD8-细胞群：如辅助型 T 细胞 CD3+/CD4-/CD8+细胞群：如杀伤型 T 细胞 由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调节补偿的基本要求。已知不存在 CD3-/

41、CD4+和 CD3-/CD8+阳性细胞，又已知 PE-Cy5 对于PE 和 FITC 的干扰很小，所以不用考虑 CD3-PE-Cy5 荧光对 CD4-FITC、 CD8-PE 荧光的干扰（不会有假阳性存在） 。补偿调节如下： 图 1-2-21 CD3-PE-CY5、 CD4-FITC 和 CD8-PE 荧光相互干扰的补偿 15在许多实验中，会用到某一标记物进行设 ”门 ”情况。此时最终观察的单参数结果而非双参数，所以往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清楚地理解补偿的形成及调节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设 ”门 ”的实验方案。 16第二章 流式

42、细胞术样品制备及分析技术 第 1 节 样本单细胞悬液的制备方法 一、新鲜实体组织样本的制备 FCM 对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。现在已有专门的样本制备仪（见图 2-1-1） ，但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分散组织细胞的方法有如下 3 种。

43、 图 2-1-1 流式细胞术自动细胞分离器（ BD， Medmachine） （一） 酶消化法 1、作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有 3 方面： 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等； 可以水解组织间的粘多糖等物质； 可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异

44、作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2、注意事项： 酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低； 要注意酶的使用浓度和消化时间； 要注意酶活性的 pH 值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等； 要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3、方法学程序 （ 1）将适合于酶消化的组织置于离心管中； 17（ 2）将选好的酶溶液 1-2ml 加入盛有被消化组织的试管中； （ 3）一般消化 20-30 min（恒温 37或室温） ，消化期间要间断振荡或吹打； （ 4）终止消化，收集细胞悬液，以 300 目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去

45、细胞碎片； （ 5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。 （二） 机械法 机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用 300 目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。 1、剪碎法： （ 1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水； （ 2）用剪刀将组织剪至匀浆状； （ 3）加入 10ml 生理盐水； （ 4）用吸管吸取组织匀浆，先以 100 目尼龙网过滤到试管中； （ 5）离心沉淀 1000 rpm,3-5min，再用生理盐水

46、洗 3 遍，每次以低速（ 500-800 rpm）短时离心沉淀去除细胞碎片； （ 6）以 300 目尼龙网滤去细胞团块； （ 7）细胞用固定液固定或低温保存备用。 2、网搓法 （ 1）将 100 目， 300 目尼龙网扎在小烧杯上； （ 2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻 轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完； （ 3）收集细胞悬液， 500-800 rpm 离心沉淀 2min； （ 4）固定细胞或低温保存备用。 3、研磨法 （ 1）先将组织剪成 1-2 mm3大小组织块； （ 2）放入组织研磨器中加入 1-2 ml 生理盐水； （ 3）转动研棒，研至匀浆； （ 4）加入 1

47、0ml 生理盐水，冲洗研磨器； （ 5）收集细胞悬液，并经 300 目尼龙网过滤，离心沉淀 500-800 rpm， 1-2 min，再以生理盐水洗 3 遍，离心沉淀； （ 6）固定或低温保存细胞悬液，备用。 （三） 化学处理法 1、作用原理 化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。 2、试剂的配制 （ 1） 0.2%EDTA 配制：称 EDTA 0.2g，加入 Hank s 液 100ml，封装高压消毒。置 0-4保存； （ 2） 胰酶加 EDTA 配制：胰酶 0.25g 加 PBS（ pH7.0） 200ml，浓度 0.125%， EDTA 0.2g加 P

48、BS（ pH7.0） 100ml，浓度 0.2%。各取 40ml 混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。 3、实验方法 18（ 1）将组织切成薄片，置入试管中； （ 2）首先加入 EDTA 液 5ml，室温下 0.5h，离心弃之； （ 3）再加入胰酶 -EDTA 液 5ml。在 37恒温水浴振荡器内 30min； （ 4）用 300 目尼龙网过滤，离心沉淀 1000 rpm， 5min。再以生理盐水洗 2-3 次； （ 5）细胞固定或低温保存备用。 以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不

49、稳定；化学试剂可单独使用， 也可与其它方法结合使用； 机械法常常造成严重的细胞损伤， 单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样本和更好的 FCM 检测结果。 （四）注意事项 1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死以及细胞自溶，影响 FCM 测定结果； 2、根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成 FCM 检测结果的不稳定； 3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、 pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。 4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞； 5、在使用酶学方法