1、粗多糖含量测定方法学研究资料一、仪器与试药 1二、方法的研究 11.检测波长的测定 .22.样品及对照制备方法 .2三、方法学验证 31.线性 32.精密度实验 43.稳定性实验 44.重复性试验 45.重现性实验 56.准确度试验 5芪参颗粒粗多糖含量测定方法起草说明标志性成分粗多糖含量测定的方法来源于保健食品功效成分检测方法白鸿主编（中国中医药出版社)的第二法，该方法的原理是：多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，糖与硫酸在沸水浴中加热脱水生成羟甲基呋喃甲醛（羟甲基呋喃糠醛），再与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，其显色强度与溶液中糖的浓度成正比，在 625nm 波长下比色测定。主要研
2、究资料如下：一、仪器与试药1、仪器(1) 离心机（湘南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号 TD25-WS）；(2) 离心管：50ml ；(3) 水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号 DK-S26）；(4) 旋涡混合器（DioCote，SA8）；(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可见光分光光度计；(6) JB760-68 石英比色皿 （宜兴市伟鑫仪器有限公司）；(7) TU-1901 双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；2、试药(1) 葡萄糖：广州化学试剂厂，分析纯，批号为 20110602-1；(2) 无水乙醇：西陇化学股份有限公司，分析纯，批号为 1608
3、02 1；(3) 蒽酮：国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号为 20131127；(4) 硫酸：广州化学试剂厂，分析纯，批号为 20150404-1；(5) 葡萄糖标准液：标准称取干燥恒重的分析纯级葡萄糖 0.5000g，加水溶解，并定容至 50ml，此溶液 1ml 含 10mg 葡萄糖，用前稀释 100 倍为使用液（ 0.1mg/ml）。(6) 0.1%蒽酮硫酸溶液（ W/V）：准确称取 0.1g 蒽酮置于烧杯中，缓缓加入 100ml 80%硫酸溶解，溶解后呈黄色透明溶液。现用现配。3、试样(1) 样品颗粒：XXXXX 有限公司提供。二、方法的研究粗多糖含量测定的方法来源于保健食品功效成分
4、检测方法白鸿主编（中国中医药出版社)的第二法，本研究针对葡萄糖对照以及样品的的吸光度进行检测波长测定，如下所示：1.检测波长的测定取葡萄糖对照品溶液、样品溶液进行紫外光谱扫描，结果显示对照品和样品均在625nm 波长附近有最大吸收。序号 波长 吸光度1 760.00 0.0552 624.50 0.1542.样品及对照制备方法（1）样品提取：称取混合均匀的固体样品2.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加热1小时，冷却至室温后补加水至刻度（V1），混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀粗多糖。（2）沉淀粗多糖：准确吸取上滤液（或液体样品）5.0ml（V2），置于50m
5、l离心管中（或2.0ml于15ml具塞离心管中），加入无水乙醇20ml（或8ml），混匀，于4冰箱静置4小时以上，以4000r/min离心5min，弃去上清液，残渣用80%（V/V）乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至10ml（V3）。（3）标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml（相当于葡萄糖葡萄糖对照品紫外波长吸收图 芪参颗粒样品溶液紫外波长吸收图序号 波长 吸光度1 625.00 0.3602 509.50 0.2713 422.50 0.2620mg、0.02mg、
6、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg、0.12mg）置于10ml比色管中，补加水2.0ml，加入0.1%蒽酮硫酸溶液6ml，在旋涡混合器上混匀，置沸水浴中加热10min，取出，在流水中冷却20min后，用分光光度计在625nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。（4）样品测定：准确吸取样品待测液2.0ml（含糖量20100g），按标准曲线绘制步骤于625nm波长下测定吸光度值并求出样品含量。三、方法学验证1.线性取适量葡萄糖对照品，精密称定，加水制成 0.1094mg/ml 的葡萄糖对照品储备溶液，分别精密吸
7、取葡萄糖对照品储备溶液0ml、0.20ml 、 0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml 、1.2ml，置于 10ml 比色管中，补加水2.0ml，依法测定。得标准曲线储备液。依法测定，分别制成含葡萄糖为0、21.88g、43.76g、65.44g 、87.52g 、109.40g、131.28g 的溶液，以吸光度（Y）为纵坐标，葡糖糖对照品的含量（X ）为横坐标，绘制标准曲线，见下图，其回归方程为： y=0.00507x+0.0048（r=0.99989），试验表明葡萄糖对照品在 0131.28g 范围内呈良好线性关系。见表 1。表 1 线性考察结果含量（ g） 0 21.88
8、43.76 65.44 87.52 109.40 131.28吸光度（Y）-0.0007 0.1111 0.2209 0.3372 0.4431 0.5561 0.6635回归方程 y=0.00507x+0.0048 r=0.9999粗多糖标准曲线如下：粗多糖对照在 0131.28g 内成良好的线性关系。2.精密度实验取一供试品溶液，连续测定 6 次，记录吸光度，结果见表 2。试验结果RSD2.0 （ RSD0.44， n6），说明仪器精密度良好。表 2 仪器精密度试验测定结果序号 吸光度 平均吸光度 RSD1 0.33982 0.34143 0.34074 0.34355 0.34366 0
9、.34190.3418 0.443.稳定性实验取同一样品，按以下时间测定，记录吸光度，结果见表 3。表 3 粗多糖稳定性试验结果时间 0min 30min 1h 2h 3h 4h吸光度 0.3437 0.3409 0.3397 0.3370 0.3342 03313 1hRSD(%) 0.602hRSD(%) 0.82 4hRSD(%) 1.35 结果表明供试品溶液在显色反应完成后 4 小时内稳定。4.重复性试验取同一供试品，按供试品制备方法制备 6 份供试品溶液，并按样品及对照制备方法测定粗多糖含量，结果见表 4。表 4 粗多糖重复性试验测定结果（单位： mg/100g）样品编号 1 2 3
10、 4 5 6含量(mg/100ml) 348 343 335 330 335 338平均含量 338RSD（%） 1.91结果表明 6 份供试品溶液按照粗多糖的检测方法测定重复性好。5.中间精密度实验取同一供试品(批号：150401)，由另一操作者于不同时间、不同仪器操作，按供试品制备方法制备 6 份供试品溶液，并按样品及对照制备方法测定粗多糖含量，结果见表 5。表 5 粗多糖中间精密度试验测定结果（单位： mg/100g）标准曲线结果：含量（ g） 0 20.32 40.64 60.96 81.28 101.6 121.92吸光度（Y）0 0.098 0.196 0.296 0.394 0.
11、506 0.575回归方程 y=0.0048x+0.0015 r=0.9992样品测定结果：样品编号 1 2 3 4 5 6含量(mg/100ml) 294 285 297 273 297 287平均含量 289RSD（%） 3.20结果表明 6 份供试品溶液按照粗多糖的检测方法测定进行的中间精密度实验精密度良好。6.准确度试验采用加样回收法，精密称取本品（批号：150401，平均含量：338mg/100g ，平均吸光度：0.3449）2.0g 各 6 份，按照样品及对照制备方法中制备得样品待测液 6 份，分别从 6份待测液中吸取 1ml 置于 10ml 比色皿中，再分别精密加入 1ml 10
12、0%浓度的对照品溶液（浓度：0.03402mg/ml），依法进行测定，记录吸光度，以吸光度计算回收率，结果见表6。6 份样品回收率均在 95%105%之间，平均回收率为 103%，RSD=0.78% ，该方法准确度符合要求。表 6 粗多糖回收率试验结果对照品加入量 对照 加入对照后 回收率 RSD编号 取样量 (g) 样品吸光度 （mg） 测得吸光度 总吸光度 （%）平均值（ %） （%）1 2.0027 0.1724 0.03402 0.1688 0.3441 102 2 2.0030 0.1724 0.03402 0.1688 0.3463 103 3 2.0025 0.1724 0.03402 0.1688 0.3452 102 4 2.0020 0.1724 0.03402 0.1688 0.3472 104 5 2.0034 0.1724 0.03402 0.1688 0.3479 104 6 2.0029 0.1724 0.03402 0.1688 0.3462 103 103 0.78
