流感病毒分子生物学研究进展.pdf

1、 专 题 笔 谈 病 毒 感 染流 感 病 毒 分 子 生 物 学 研 究 进 展中 日 友 好 医 院 (100029) 安 菁 林 江 涛 流 感 病 毒 是 研 究 最 早 的 病 毒 之 一 ,主 要 原 因 与流 感 的 严 重 危 害 有 关 。 流 感 发 作 快 、 传 播 迅 速 ,短 时间 内 可 造 成 局 部 地 区 的 爆 发 或 全 球 范 围 的 流 行 ,导致 灾 难 性 的 后 果 。 从 19 世 纪 以 来 ,已 出 现 四 次 全 球性 的 流 感 大 流 行 ,最 严 重 的 一 次 (1918 1919 年 ) 全世 界 死 于 流 感 的 人 数

2、超 过 20 万 。 几 十 年 来 ,人 们 作了 大 量 的 工 作 ,试 图 运 用 分 子 生 物 学 的 手 段 从 机 理上 揭 示 流 感 病 毒 感 染 性 与 致 病 机 制 ,以 研 究 有 效 的防 治 (如 监 测 、 疫 苗 )手 段 。1 流 感 病 毒 的 基 因 组 结 构流 感 病 毒 属 于 正 粘 病 毒 科 ,是 RNA 病 毒 。 依 据其 核 蛋 白 (NP)抗 原 性 的 差 异 分 成 A、 B、 C 三 型 ,这 三个 型 分 别 在 基 因 组 结 构 、 多 肽 组 成 、 感 染 性 和 致 病 性等 方 面 存 在 差 异 。流 感 病

3、 毒 为 有 包 膜 的 病 毒 ,包 膜 分 内 、 外 两 层 。内 层 包 膜 由 基 质 蛋 白 M1 构 成 ,M1 在 颗 粒 核 蛋 白 体(vRNP)的 胞 质 、 胞 核 间 的 有 序 转 移 及 病 毒 体 的 成 熟过 程 中 具 有 重 要 的 调 节 作 用 。 外 层 包 膜 由 一 脂 质 双层 构 成 ,其 上 面 嵌 有 三 种 病 毒 蛋 白 :具 有 血 凝 素 活 性的 蛋 白 质 HA、 具 有 神 经 氨 酸 酶 活 性 的 蛋 白 质 NA 和基 质 蛋 白 M2。 包 膜 内 为 病 毒 基 因 组 与 病 毒 RNA 聚合 酶 亚 单 位 P

4、B1、 PB2、 PA 以 及 NP 形 成 的 具 有 特 定空 间 构 象 的 结 构 ,称 为 vRNP ,具 有 依 赖 RNA 的 RNA聚 合 酶 活 性 。流 感 病 毒 基 因 组 由 7 个 (C型 病 毒 ) 或 8 个 (A、 B型 )分 节 段 的 单 股 负 链 RNA 构 成 ,每 个 RNA 节 段 的两 端 都 有 相 对 保 守 的 非 编 码 序 列 ,如 5 端 存 在 13 个核 苷 酸 ,3 端 存 在 12 个 核 苷 酸 ,且 5 端 与 3 端 反 向互 补 形 成 锅 柄 结 构 。 这 些 结 构 参 与 病 毒 vRNA 的 复制 和 mR

5、NA 的 转 录 ,在 RNA 聚 合 酶 结 合 活 性 、 启 动子 活 性 、 poly(A)化 作 用 以 及 激 活 核 酸 内 切 酶 活 性 中具 有 重 要 作 用 ,是 流 感 病 毒 复 制 、 转 录 、 包 装 的 重 要调 控 成 分 。 每 个 RNA 节 段 包 括 至 少 一 个 开 放 阅 读框 架 (ORF) ,如 :A 型 流 感 病 毒 的 各 RNA 节 段 及 其 编码 的 病 毒 蛋 白 为 RNA1 - PB2、 RNA2 - PB1、 RNA32PA、RNA4 - HA、 RNA5 - NP、 RNA6 - NA、 RNA7 - M1 和M2、

6、 RNA32PA、 RNA8 - NS1 和 NS2 等 。2 流 感 病 毒 的 复 制 及 调 控流 感 病 毒 大 多 在 宿 主 细 胞 核 中 复 制 其 基 因 组 ,通 过 质 膜 或 细 胞 器 膜 芽 生 形 成 成 熟 的 病 毒 颗 粒 。 流感 病 毒 基 因 组 为 负 链 RNA ,与 具 有 活 性 的 转 录 酶 复合 物 和 其 他 负 链 RNA 病 毒 相 同 ,vRNA、 cDNA 和 cD2NA转 录 形 成 的 RNA 均 不 具 有 感 染 性 ,只 有 形 成RNP并 转 染 宿 主 细 胞 后 才 能 在 宿 主 细 胞 内 起 始 病 毒基

7、因 的 复 制 和 表 达 。流 感 病 毒 侵 入 宿 主 细 胞 依 赖 于 HA 的 凝 集 素 位点 与 宿 主 细 胞 表 面 的 唾 液 酸 的 结 合 。 HA 介 导 病 毒包 膜 与 内 体 膜 的 融 合 ,使 病 毒 壳 衣 壳 释 放 进 入 胞 质 。流 感 病 毒 的 脱 壳 与 内 体 的 低 pH 环 境 引 发 的 病 毒 核衣 壳 结 构 改 变 有 关 ,但 低 pH诱 导 核 衣 壳 结 构 改 变 的分 子 机 制 尚 不 清 楚 。 当 病 毒 脱 壳 ,vRNP 在 ATP 供 能的 条 件 下 ,很 快 通 过 宿 主 细 胞 核 孔 复 合 物

8、 (NPC) 向核 内 转 运 。 vRNP向 宿 主 细 胞 核 内 转 运 的 调 控 与 NP和 胞 质 因 子 NPI21、 核 转 运 受 体 、 Ran ( TC4) 及 P10(NTF2)有 关 。 只 有 当 vRNA 与 NP同 时 存 在 时 ,vRNA才 可 转 运 到 细 胞 核 内 。 流 感 病 毒 蛋 白 的 合 成 分 两 个时 项 。 NP、 RNA 聚 合 酶 亚 基 和 NS1 在 感 染 后 最 初 2 3 小 时 即 生 成 。 其 他 蛋 白 质 如 HA、 NAM1、 M2 和NS2 合 成 较 晚 。 病 毒 蛋 白 的 合 成 可 能 受 到

9、病 毒 mR2NA 向 核 外 运 输 的 调 节 ,并 可 能 与 病 毒 蛋 白 NS1 的 功能 有 关 。 对 病 毒 蛋 白 合 成 时 间 的 控 制 在 病 毒 感 染 周期 中 具 有 重 要 作 用 ,与 病 毒 核 衣 壳 的 组 装 、 vRNP 的成 熟 和 释 放 等 相 关 。 流 感 病 毒 在 特 定 时 间 内 合 成 的蛋 白 成 分 均 要 通 过 宿 主 细 胞 的 介 导 进 入 核 内 以 完 成vRNP的 组 装 。 构 成 vRNP的 主 要 蛋 白 成 分 是 NP ,为子 代 vRNA 的 合 成 所 必 需 ,在 RNA 复 制 的 同 时

10、 ,子 代vRNA 随 即 与 NP 形 成 具 高 级 结 构 的 子 代 vRNP。 病1辽 宁 医 学 杂 志 1999 年 第 13 卷 第 1 期毒 vRNP合 成 后 3 小 时 ,vRNP 开 始 通 过 NPC 由 核 内向 胞 质 转 移 ,持 续 数 小 时 。 M1 是 vRNP 向 核 外 转 运的 动 力 。 只 有 在 细 胞 中 合 成 M1 ,并 且 进 入 核 后 才 发生 vRNP的 核 外 转 运 。3 反 向 遗 传 操 作 和 流 感 病 毒 载 体 的 改 造 与 应 用1989年 由 Luyties 等 人 将 外 源 性 RNA 分 子 导 入流

11、 感 病 毒 颗 粒 的 基 因 组 中 ,首 创 了 流 感 病 毒 以 及 其他 负 链 RNA 病 毒 分 子 生 物 学 研 究 的 反 向 遗 传 操 作方 法 。 具 体 而 言 ,他 们 将 报 告 基 因 CAT的 反 义 与 流感 RNA 病 毒 A/ PR/ 8/ 34 毒 株 基 因 组 3 和 5 端 的 非编 码 区 相 连 。 在 体 外 ,纯 化 的 流 感 病 毒 RNA 聚 合 酶可 实 现 CAT负 链 RNA 的 转 录 。 将 CAT和 RNA 与 流感 病 毒 RNA 聚 合 酶 复 合 物 在 体 外 组 建 RNP。 将 其转 染 宿 主 细 胞

12、MDCK,CAT的 RNA 在 细 胞 内 复 制 、 转录 和 表 达 ,并 形 成 含 有 CAT 的 RNA 的 嵌 合 子 代 病毒 。流 感 病 毒 反 向 遗 传 操 作 方 法 的 建 立 使 得 流 感 病毒 可 被 改 造 成 表 达 外 源 基 因 的 病 毒 载 体 。 利 用 RNP转 染 系 统 ,结 合 外 源 基 因 和 宿 主 细 胞 的 辅 助 功 能 ,可确 定 不 同 的 筛 选 方 法 以 获 得 具 有 目 的 基 因 的 转 染 子代 病 毒 。RNP转 染 系 统 和 筛 选 方 法 的 建 立 和 完 善 使 外 源基 因 的 表 达 成 为 可

13、 能 。 以 流 感 病 毒 为 载 体 ,表 达 抗原 表 位 ,可 激 发 宿 主 的 主 动 免 疫 ,已 应 用 于 预 防 接 种工 程 中 。 流 感 病 毒 主 要 侵 染 人 呼 吸 道 上 皮 细 胞 ,在激 发 机 体 局 部 粘 膜 免 疫 方 面 有 重 要 作 用 。 可 利 用 这一 特 点 ,以 流 感 病 毒 作 为 载 体 ,将 其 他 病 原 体 的 重 要宿 主 保 护 性 抗 原 的 主 要 表 位 呈 递 给 宿 主 免 疫 系 统 ,激 发 宿 主 的 主 动 免 疫 。 HA 是 流 感 病 毒 的 主 要 免 疫原 ,其 中 的 抗 原 表 位

14、包 括 A、 B、 C、 D、 E 五 个 结 构 域 。将 其 他 病 原 体 的 抗 原 表 位 取 代 HA 的 结 构 域 ,可 获得 转 染 体 流 感 病 毒 ,如 :含 有 疟 原 虫 的 环 孢 子 蛋 白(CS蛋 白 )的 转 染 体 流 感 病 毒 ,含 有 HIV - 1 的 gp120的 转 染 体 流 感 病 毒 等 。 重 组 流 感 病 毒 转 染 体 可 激 发人 体 产 生 对 相 应 嵌 合 病 原 体 的 主 动 免 疫 。4 流 感 病 毒 分 子 流 行 病 学19 世 纪 全 球 共 出 现 四 次 流 感 大 流 行 。 第 一 次发 生 于 19

15、18 1919 年 ,称 为 “ 西 班 牙 流 感 ” ( SpanishInfluenza) 。 它 造 成 灾 难 性 的 后 果 ,全 球 有 二 千 万 以上 的 人 死 亡 ,主 要 分 布 在 年 青 人 中 。 感 染 来 自 鸟 类的 A 型 流 感 病 毒 H1N1 亚 型 ,1910 1920 年 通 过 猪 传染 人 类 。 第 二 次 发 生 于 1957 年 ,称 为 “ 亚 洲 流 感 ”(Asian Influenza) 。 最 早 出 现 于 中 国 贵 州 ,迅 速 传 播全 世 界 。 感 染 来 自 A 型 流 感 病 毒 H2N2 亚 型 (也 称甲

16、2 亚 型 ) 。 这 一 亚 型 为 人 以 禽 流 感 病 毒 通 过 基 因重 配 而 来 ,因 其 HA、 NA、 PBI 三 个 基 因 片 段 来 源 于 鸟流 感 病 毒 ,其 余 的 基 因 片 段 来 自 当 时 人 群 的 流 感 病毒 。 第 三 次 发 生 于 1968 年 ,称 为 “ 香 港 流 感 ” ( HongKong Influenza) 。 最 早 出 现 于 中 国 香 港 ,后 传 播 到 日本 、 美 国 等 地 。 感 染 来 自 A 型 流 感 病 毒 H3N2 亚 型(也 称 甲 3 亚 型 ) 。 这 一 亚 型 同 样 认 为 是 人 以

17、禽 流 感病 毒 通 过 基 因 重 配 而 来 ,因 其 HA、 PBI 基 因 来 源 于鸟 流 感 病 毒 ,其 余 的 基 因 节 段 来 自 当 时 人 群 的 流 感病 毒 。 第 四 次 发 生 于 1977 年 ,称 为 “ 俄 国 流 感 ” (Rus2sian Influenza) 。 最 早 出 现 于 中 国 东 北 和 华 北 地 区 ,传播 较 慢 ,主 要 侵 袭 年 青 人 和 家 禽 。 感 染 来 自 A 型 流感 病 毒 H3N2 亚 型 流 行 基 础 上 H1N1 亚 型 的 重 视 。流 感 病 毒 的 分 子 结 构 和 宿 主 界 限 有 利 于

18、 流 感 病毒 的 复 发 发 作 和 疾 病 的 流 行 。 从 分 子 结 构 上 看 ,流感 病 毒 分 A、 B、 C 三 型 ,A 型 流 感 病 毒 又 分 许 多 亚型 ,至 今 HA 有 15 个 亚 型 ,NA 有 9 个 亚 型 。 流 感 病毒 的 基 因 组 分 节 段 ,易 发 生 基 因 重 配 ,即 不 同 来 源 的流 感 病 毒 基 因 节 段 包 被 在 一 起 形 成 新 的 毒 粒 。 流 感病 毒 的 基 因 突 变 率 很 高 ,尤 其 HA、 NA 基 因 极 易 发 生点 突 变 ,导 致 其 编 码 的 蛋 白 质 氨 基 酸 序 列 的 改

19、变 ,从而 逃 避 宿 主 的 免 疫 系 统 的 识 别 和 清 除 ,此 外 HA 蛋白 分 子 上 个 别 关 键 氨 基 酸 位 点 的 突 变 ,尤 其 是 受 体结 合 部 位 的 氨 基 酸 发 生 替 换 ,就 有 可 能 造 成 毒 粒 致病 性 和 传 播 能 力 的 改 变 。 流 感 病 毒 的 宿 主 界 限 表 现为 不 同 宿 主 中 流 感 病 毒 亚 型 的 分 布 不 同 。 在 自 然 界中 ,流 感 病 毒 的 宿 主 范 围 相 当 广 ,有 鸟 类 及 哺 乳 类 。鸟 类 中 存 在 所 有 的 HA、 NA 亚 型 。 猪 中 为 H1N1 和H

20、3N2 亚 型 及 C型 流 感 病 毒 ,人 群 出 现 H1 H3 ,N1N2 的 亚 型 组 合 ,H5N1 亚 型 和 B 型 流 感 病 毒 。 由 于在 不 同 宿 主 体 内 流 感 病 毒 所 受 的 选 择 压 力 不 同 ,其进 化 速 率 有 相 当 大 差 异 。 鸟 类 流 感 病 毒 相 当 保 守 ,而 人 类 流 感 病 毒 则 进 化 较 快 ,尤 其 是 控 制 表 明 糖 蛋白 的 基 因 HA、 NA 因 受 到 宿 主 免 疫 系 统 的 选 择 压 力 ,其 进 化 速 度 要 比 其 他 基 因 快 得 多 。5 流 感 灭 活 疫 苗 的 研 究

21、 和 使 用至 今 为 止 , 感 染 人 类 的 流 感 病 毒 有 H1N1、H2N2、 H3N2、 H5N1 亚 型 的 A 型 流 感 病 毒 和 B 型 流 感病 毒 。 比 较 活 跃 的 有 H3N2、 H1N1 亚 型 的 A 型 流 感病 毒 、 B 型 流 感 病 毒 和 1997 年 5 月 出 现 的 H5N1 亚2 辽 宁 医 学 杂 志 1999 年 第 13 卷 第 1 期型 的 A 型 流 感 病 毒 。对 接 种 三 价 流 感 灭 活 疫 苗 含 类 A/ 武 汉 / 359/ 95(H3N2) 、 类 A/ 巴 伐 利 亚 / 7/ 95 ( H1N1)

22、和 类 B/ 北 京 /184/ 93 病 毒 血 凝 素 各 15 g者 用 HI试 验 测 定 血 清 抗血 凝 素 抗 体 。 50 % 100 % (平 均 81 %) 的 成 人 和27 % 100 % (平 均 68 %) 的 老 年 人 接 种 血 清 后 抗H3N2亚 型 的 A 型 流 感 病 毒 的 HI 抗 体 滴 度 40。100 %的 成 人 和 88 % 100 %(平 均 96 %)的 老 年 人 接种 血 清 后 抗 H1N1 亚 型 的 A 型 流 感 病 毒 的 HI 抗 体滴 度 40。 92 % 100 % (平 均 96 %) 的 成 人 和 53 %

23、 97 %(平 均 81 %)的 老 年 人 接 种 血 清 后 抗 B 型 流 感病 毒 的 HI抗 体 滴 度 40。根 据 上 一 年 流 感 病 毒 型 别 的 流 行 情 况 ,选 择 当年 的 预 防 疫 苗 类 型 。 以 1998 1999 年 为 例 ,由 于1997 1998 年 流 感 流 行 季 节 ,A 型 流 感 病 毒 H3N2 亚型 、 H1N1 亚 型 和 B 型 流 感 病 毒 均 发 生 流 行 ,香 港 地区 又 出 现 A 型 流 感 病 毒 H5N1 亚 型 ,1998 1999 年 的预 防 工 作 将 针 对 上 述 型 别 的 流 感 病 毒

24、进 行 。单 纯 疱 疹 病 毒 性 脑 炎中 国 医 科 大 学 第 一 临 床 学 院 神 经 科 (110001) 高 旭 光单 纯 疱 疹 病 毒 性 脑 炎 (herpes simplex encephalitis,HSE)由 单 纯 疱 疹 病 毒 (HSV)感 染 引 起 ,又 称 急 性 包涵 体 脑 炎 ,是 最 常 见 的 非 传 染 性 病 毒 性 脑 炎 。 本 病致 死 致 残 率 高 ,近 年 来 随 着 诊 断 学 手 段 及 治 疗 的 不断 进 步 ,加 上 对 HSE 认 识 水 平 的 提 高 ,若 能 早 期 认症 和 及 早 治 疗 ,可 能 降 低

25、其 致 死 致 残 率 。1 流 行 病 学世 界 各 地 均 有 发 生 ,我 国 每 年 都 有 病 例 报 道 。美 国 每 年 大 约 有 2000 例 HSE ,占 各 种 病 毒 性 脑 炎 的10 % 20 % ,年 发 病 率 约 为 3/ 10 万 人 口 。 成 人 主 要为 HSV21 感 染 , HSV22 主 要 引 起 新 生 儿 脑 炎 。 未 经治 疗 的 HSE病 死 率 高 达 70 % ,存 活 者 多 遗 有 神 经 功能 缺 失 ,即 使 做 出 正 确 的 诊 断 和 恰 当 的 治 疗 ,其 病 死率 仍 在 30 %左 右 。 本 病 无 季 节

26、 性 ,全 年 都 可 散 在 发病 ,各 年 龄 组 均 有 发 病 ,无 明 显 的 性 别 差 异 。2 发 病 机 理 与 病 理三 分 之 一 的 病 人 继 发 于 原 发 性 HSV21 感 染 ,过去 认 为 HSV 潜 伏 在 三 叉 神 经 半 月 节 或 鼻 粘 膜 ,活 化的 病 毒 经 三 叉 神 经 轴 索 或 嗅 束 侵 入 中 枢 神 经 系 统 。现 认 为 HSV 可 能 直 接 潜 伏 于 脑 组 织 ,在 机 体 抵 抗 力降 低 时 发 病 ,但 一 些 免 疫 抑 制 的 病 人 HSE 发 病 并 不增 多 ,可 能 还 有 另 外 的 发 病 机

27、 制 。 临 床 有 反 复 口 唇或 外 生 殖 器 HSV 感 染 病 史 者 , HSE 并 不 多 见 ,表 明长 期 反 复 HSV 感 染 者 有 一 定 的 免 疫 力 。 渡 过 新 生儿 期 ,几 乎 所 有 的 HSE 均 为 HSV21 感 染 引 起 。 HSV22 还 可 引 起 成 人 良 性 无 菌 性 脑 膜 炎 。 本 病 的 病 理 改变 多 呈 不 对 称 性 分 布 ,以 海 马 回 、 颞 叶 内 下 部 、 额 叶的 眶 部 受 累 最 为 显 著 。 上 述 部 位 出 现 严 重 的 出 血 坏死 和 软 化 灶 ,在 脑 病 变 部 位 及 脑

28、 膜 有 充 血 、 渗 出 ,血管 周 围 淋 巴 细 胞 和 浆 细 胞 浸 润 ,可 见 噬 节 和 卫 星 现象 ,急 性 期 在 受 累 部 位 可 见 神 经 元 和 神 经 胶 质 细 胞内 有 嗜 酸 性 包 涵 体 。3 临 床 表 现各 年 龄 均 可 发 病 ,5 30 岁 和 50 岁 以 上 为 发 病高 峰 ,6 10 岁 的 儿 童 占 10 %。 急 性 起 病 ,感 染 初 3 7 天 首 先 出 现 上 呼 吸 道 感 染 症 状 。 绝 大 多 数 伴 有发 热 ,高 热 不 退 ,体 温 可 达 41 。 一 般 在 发 病 1 周 内出 现 神 经 系

29、 统 症 状 ,如 头 痛 、 呕 吐 、 部 分 性 痫 性 发 作和 意 识 障 碍 。 一 些 病 人 出 现 嗅 幻 觉 或 味 幻 觉 、 嗅 觉丧 失 、 颞 叶 癫 痫 、 短 暂 的 人 格 改 变 、 精 神 症 状 、 记 忆 障碍 、 失 语 和 偏 瘫 等 ,笔 者 曾 遇 到 1 例 有 幻 听 症 状 的HSE。 也 可 出 现 颅 神 经 损 害 、 视 野 缺 损 等 ,少 数 病 人可 有 共 济 失 调 。 病 情 严 重 者 ,在 起 病 24 72 小 时 内出 现 脑 水 肿 和 脑 疝 ,很 快 导 致 昏 迷 和 呼 吸 停 止 。HSE最 常 见

30、 的 症 状 是 发 热 、 抽 搐 、 昏 呆 和 呕 吐 ,年 龄小 的 常 出 现 抽 搐 。 预 后 与 意 识 状 态 、 年 龄 以 及 应 用抗 病 毒 药 物 的 早 晚 有 直 接 关 系 ,当 Glassgow 昏 迷 判分 在 6 分 以 下 、 年 龄 大 于 30 岁 、 发 病 4 天 以 后 才 开始 应 用 抗 病 毒 药 物 者 预 后 不 好 。新 生 儿 HSE主 要 源 于 母 亲 HSV 感 染 ,多 在 生 后4 周 内 发 病 ,一 般 表 现 三 种 形 式 :皮 肤 、 眼 和 口 唇 疱疹 ;中 枢 神 经 系 统 感 染 包 括 中 枢 神 经 系 统 在 内 的 全身 播 散 性 感 染 。 后 两 种 常 危 及 生 命 。 新 生 儿 HSE往 往 发 现 较 晚 ,主 要 症 状 包 括 发 热 、 昏 睡 、 激 惹 和 痫性 发 作 。 新 生 儿 HSE 呈 弥 漫 脑 损 害 改 变 ,可 直 接 导致 脑 软 化 。 与 成 人 HSE 不 同 ,尽 管 及 时 采 取 抗 病 毒药 物 治 疗 ,病 死 率 仍 很 高 ,75 %的 患 儿 或 死 亡 、 或 遗有 永 久 性 的 神 经 功 能 障 碍 。3辽 宁 医 学 杂 志 1999 年 第 13 卷 第 1 期