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类型sars病毒论文流感病毒论文:RNA分子抗SARS病毒的应用和研究进展.doc

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    1、 sars 病毒论文流感病毒论文:RNA 分子抗 SARS 病毒的应用和研究进展严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syn-drome, SARS)又称传染性非典型肺炎,是一种严重急性呼吸系统传染病,系由 SARS 相关冠状病毒 (Severe acute re-spiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)引起的新发传染病1 。SARS-CoV 是单股正链 RNA 病毒 ,呈现典型冠状病毒基因组结构特征:5 - 复制酶基因-S 基因-E 基因-M 基因-N 基因-3 以及 5 和 3端非编码区2。SA

    2、RS-CoV 侵入宿主细胞后,首先以病毒基因组 RNA 为模板,翻译自身 RNA依赖的 RNA 聚合酶 ,然后利用这种聚合酶完成病毒负链亚基因组 RNA 转录、各结构蛋白的 mRNA 转录以及病毒基因组 RNA 复制等病毒粒增殖过程中的一系列环节3。目前SARS 治疗的主要策略有广谱抗生素、抗病毒剂和免疫调制疗法,但是很少的药物能够有效的对抗病毒4,因而对抗SARS 治疗而言 ,改进治疗方案、开发更加特异性的药物和更有效的疗法十分重要。基于核酸的基因调控分子是长度约 20 个碱基的人工合成性单链或双链 DNA 或 RNA,这些分子包括核酸配体、反义寡核苷酸、核酶和小干扰性 RNA,这些分子以序

    3、列特异性方式针对细胞或病毒的 mRNA,造成靶mRNA 断裂和 /或阻断靶 mRNA 的转录与翻译起始,因此成为基因功能分析和抗病毒药物开发的有力工具。本文就这些不同类型 RNA 分子在抗 SARS 病毒的应用及机制研究的进展进行综述。1 RNA 适配子在抗 SARS-CoV 中的应用适配子(aptamer)是能与多种目标分子以高亲和力和高特异结合的核酸序列,从原始文库中筛选与配体相对应的适配子的技术称为指数级富集配体系统进化技术,即SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrich-ment)5-7。用于抗病毒的适配子是以病

    4、毒基因表达调控有关的蛋白酶和关键基因作为主要靶点,如 SARS-CoV 的 3CL蛋白酶和 NTPase/解旋酶 ,还有双链 RNA/DNA 解旋、RNA加帽活性中的关键基因均是理想的抗病毒靶点8。目前已经利用 SELEX 技术从多种文库中筛选到能够有效抑制解旋酶活性的适配子。Jang 等9 筛选出针对 SARS-CoV 的非结构蛋白 nsP10 的 RNA 适配子,可以有效抑制解旋酶的活性。然而,天然 RNA 在体内的稳定性差,极易被体内各种 RNA 核酸酶降解,故难以在体内应用。Shum 等10筛选到 G-四倍体和非 G-四倍体两种构象的适配子。但是仅非 G-四倍体能够特异性地抑制病毒解旋

    5、酶活性,而 G-四倍体却不能。原因在于非 G-四倍体经生物素或反向胸腺嘧啶修饰后在血清中的稳定性增强,这种结构性选择及对稳定性的修饰作用为寻找解旋酶适配子提供了新线索。适配子具有靶分子范围广、亲和力和特异性高、稳定性好、制备方便等优点。随着对SARS-CoV 感染复制机制的深入研究以及核酸适配体技术的发展,一些有效且低毒的适配体分子被筛选出来,为抗SARS 治疗带来了希望,但是核酸适配子易被体内的核酸酶降解,因此它的修饰,转移进细胞等方面也需要进一步研究。2 反义 RNA 在抗 SARS-CoV 中的应用反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide, ASON)指能够以碱基

    6、配对方式与特定 DNA 和 RNA 结合并阻止它们转录和翻译的短核酸片段(反义链片段)。反义 RNA 与 mR-NA的特异性互补结合可以抑制后者的翻译。最早于大肠杆菌的产肠杆菌素的 Col E1 质粒中发现通过反义 RNA 控制mRNA 翻译 ,后来许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA11。就反义 RNA 抗病毒方面的研究而言,早在 1978年就有报道表明反义寡核苷酸可以抑制劳氏肉瘤病毒的复制12 。利用反义 RNA 能与特定的 RNA 病毒作用,直接抑制这些病毒的复制,从而阻断 RNA 病毒的繁殖,达到抗病毒性疾病的目的。ASON 在抑制 SARS-CoV 蛋白表达的实际应用中,主要通过

    7、化学修饰法来提高 ASON 的稳定性,体外试验证明硫代修饰的 ASON 能够下调 SARS-CoV 结构蛋白E、 M、N 的表达量 13。而 3端修饰的 ASON 能够抑制SARS-CoV 突起蛋白(Spike Protein, SP)的 mRNA 的表达水平14 。在抗病毒剂中广泛研究的肽缀合反义吗啉代寡聚体(Peptide-conjugated antisense morpholino oligomers, P-PMO)具有更强的反义作用,针对 SARS-CoV 5UTR 中转录调控序列合成的 P-PMO 可以减少病毒诱导的细胞病理学并减慢病毒在细胞间的扩散15。利用与 SARS-CoV

    8、种系关系很近的鼠科肝炎病毒(MHV)在体内建立感染模型,显示与 MHV病毒基因组 RNA5端配对的 P-PMO 可以减少病毒复制和小鼠组织损伤,但是这种 P-PMO 也具有潜在毒性16。Krahling 等用磷酰二胺吗啉修饰的 PPMO 可以抑制细胞凋亡17。而感染细胞的抗凋亡水平的升高能够减少细胞的自杀现象18。反义核酸技术原理简单、前景诱人,在基础研究及抗病毒的研究中都显示出很大的优势和潜力,在抗 SARS的治疗中也有潜在的应用价值,但在实际使用中还存在一些不容忽视的问题,如许多 ASONs 缺乏特异性且具有免疫刺激性和激活补体的毒副作用,这些都需要我们寻找更有效的途径来改造和更新原有的思

    9、路,才能使它作为分子药物不断深入的研究。3 核酶在抗 SARS-CoV 中的应用核酶是一类本身具有酶剪切活性的 RNA,能够以序列特异性方式催化靶 RNA 的切割。迄今发现的核酶从结构上主要分为两大类:锤头型核酶和发夹型核酶。核酶与反义 RNA不同,它们具有催化活性,无免疫原性,在应用上可能比反义药物具有更大的潜力,因此越来越广泛地应用于基因研究与治疗各领域。体内和体外实验已经证明了核酶可以抑制HIV、HBV 、HCV 病毒的复制,近几年也逐渐开始了动物水平的评价,已经批准核酶在抗 HIV 和癌症方面进行临床试验19-21。Mizutani 等报道了核酶与同源于 SARS-CoV 的病毒 MH

    10、V 的相互作用,其中与 MHV 基因组 RNA 的 5端结合的核酶能够抑制 MHV 增殖22。Maeda 等合成了与MHV 的 RNA 聚合酶特异结合的两种锤头型核酶:S-核酶和L-核酶,能够使感染的子代病毒颗粒大量减少,尽管 S-核酶剪切 RNA 的过程比 L-核酶慢,但是这两种核酶的作用效果是相同的23,24。然而,如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等问题对核酶今后的应用和发展提出了新的挑战。因此,不断采取新的设计策略,提高核酶的切割效率,通过人工筛选或修饰手段构建新的人工核酶并扩大核酶催化反应谱将成为核酶研究的主要内容

    11、之一。虽然核酶抗 SARS-CoV 的作用仍在研究中,至今还没有明确结果,但是通过研究它对 SARS-CoV 种系很近的病毒的作用,可以推测核酶在抗 SARS-CoV 基因治疗中的潜在效果,为预防和治疗SARS 又开拓了一条可行之路,很可能成为未来抗病毒研究的热点。4 siRNA 在抗 SARS-CoV 中的应用RNAi(RNA interference, RNAi)最早在研究秀丽新小杆线虫(Celegans)反义 RNA 的过程中发现25。在生物体内,双链 RNA 被核糖核酸酶切割成长度 21-23nt 的小干扰性RNA(small interfering RNA, siRNA),它能与特定

    12、 mR-NA 结合引起其降解而导致基因沉默。有关报道显示,siR-NA 在细胞和动物水平均可以有效抑制病毒复制26,27。siRNA 比ASON 具有更强的优势和潜力,为研究抗 SARS 病毒感染过程提供了新的研究工具并且已成为当前的研究热点之一。众多研究者确定了针对 SARS-CoV 基因组的 siRNA 作用的不同靶位点,并在体外实验和动物实验中利用这些靶位点通过 RNAi 方法展示了高效的抗病毒作用。在体外细胞实验中证实与 SARS-CoV 的 S 蛋白特异结合的 siRNA 能够降低 S 蛋白的表达 ,并且在动物实验中证明 siRNA 的作用能够减轻发病症状28,29 。目前广泛应用化

    13、学合成和重组质粒法产生 siRNA。以病毒 RNA 聚合酶基因为靶点的 siR-NA 重组表达质粒转入细胞后能够降低病毒 RNA 和病毒蛋白的表达水平,从而抑制病毒复制30。与 SARS-CoV 的非结构蛋白 NSP1 序列特异性结合的质粒表达型 siRNA 可以使感染后的细胞病变减轻、活细胞显著增加、病毒空斑明显减少31。化学合成法因其合成效率更高,吸引了更多研究者的关注。由于对靶基因不同部位的 siRNA 具有不同的干扰效率,故需要对设计的 siRNA 进行筛选。Zheng32等从化学合成法产生的 48 条针对 SARS-CoV 基因组中各基因编码区的siRNA 筛选到 4 种有效抑制靶基

    14、因的分子,并且联合应用可以显著提高对靶基因表达的抑制效应。同样,Shi 等化学合成针对 SARS-CoV 中 E、M 和 N 蛋白基因的 siRNA 能使各个靶基因的表达水平降低 80%33。Wu 等合成的针对 SARS-CoV 前导序列、 TRS、5-UTR 和 SP 序列的 siRNA 能够抑制 SARS-CoV 复制34 。同时,体外实验证实了针对 SARS-CoV 前导序列的 siRNA 的抑制强度高于针对 S 基因的siRNA 和反义寡核苷酸35, 这两组结果说明前导序列可以作为有效靶点。尽管众多研究以病毒基因组中的全长 ORF 作为研究 SARS-CoV 病毒复制的主要对象,但是实

    15、验证明亚基因组 RNAs(subgeomic RNA,sgRNA)对病毒的复制增殖也很重要。以 SARS-CoV sgRNA 设计的 siR-NA 能够抑制病毒蛋白的表达,使子代病毒的增殖明显减少36。在 RNAi 作用过程中,siRNA 的稳定性和特异性很重要。利用具有高亲和力的核苷酸类似物-锁定核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)修饰 siRNA 后,使其在血清中的稳定性大大提高,并且对靶基因作用效率高于未修饰的 siRNA37。siRNA 逐渐成为抗病毒治疗研究领域的热门工具,为开发可以预防和治疗 SARS 的潜在药物创造了条件。在 siRNA 的应用过程中,怎样设计

    16、出有效的 siRNA 序列,如何有效地将 siRNA 分子有效的转移到靶器官并进入靶细胞,怎样提高 siRNA 的稳定性等问题还需解决。但是关于 siRNA 的许多研究结果使大家深信,siRNA是非常有希望被应用于临床的。5 结 语已知新型冠状病毒 SARS-CoV 是引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的病原体,目前尚无有效的针对性预防和治疗药物。随着分子生物学的进展,基因治疗成为新的抗病毒策略。RNA 相关的抗病毒策略能够针对病毒基因组而对宿主的影响较小,因而在近期的抗 SARA 治疗中得到广泛关注,也取得了很大的进展。SARS-CoV 基因组测序已经完成,对病毒的分子生物学特性有了一定了

    17、解,针对病毒复制、增殖相关的主要序列为靶点设计的 RNA 适配分子、反义核酸、核酶、siRNA 能够有效的抑制 SARS-CoV 的复制,现在成为医学和生物学研究的前沿和热点。本文主要阐述了 RNA 相关分子抗病毒机制取得的一些最新进展,国内外的科学家合成筛选出很多基于 RNA 的基因调控分子,体内体外实验均有抗SARS 病毒的作用。但是这些相关技术仍然需要克服核酸类化合物的固有限制性,如将合成的目的序列导入细胞的方法、在细胞内的稳定性、如何避免脱靶现象和非特异性反应以及获得高疗效等。尽管还有很多工作要做,但是这些 RNA 相关生物技术的研究结果已经显示了诱人的前景,为研究抗SARS 病毒药物

    18、提供了可行性,具有广阔的应用前景和临床实用价值。参考文献:1 Marra M A, Jones S J, Astell C R, et alThe genomesequence of the SARS associated coronavirusJ. Sci-ence, 2003, 300(5624): 1399-1404.2 Paul A, Rota M, Steven O, Stephan S, et al. Charac-terization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory SyndromeJ.

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