1、武汉友芝友生物制药有限公司1循环肿瘤细胞检测及临床应用中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对 CTCs 的富集和检测技术研究进展，以及 CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。关键词：循环肿瘤细胞 富集 检测 临床 Abstract: Circulating tumor cells come from the primary tumor proliferation,andproliferation, and then enter into
2、 the blood or lymphatic system. Circulating tumor cells are rare in the blood. Generally, circulating tumor cells should be enriched first, and then detected. A variety of cell enrichment and detection technologies have been developed. This paper reviews the research progress in CTCs enrichment and
3、detection techniques, as well as analysis of CTCs in clinical and research.Key words: Circulating tumor cells enrichmentcells detectionenrichment detection clinical 癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs) 从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡1。 1869 年，Ashworth 在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似
4、肿瘤的细胞，并首次提出了 CTCs 的概念2。从此，越来越多的研究表明，CTCs 的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT) ，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着， 、发展成远端转移3。由于 CTCs 能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs 的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs 的富集和计数技术已经建立，其中 CTCs 的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌4， 、前列腺癌5 ，、结直肠癌等6 。基于临床试验，美国 FDA 批准了一种临床检测
5、 CTCs 的 Cell Search 技术，用于上述癌症的 CTCs 的富集和计数。Cell Search 技术成功的证明了 CTCs 确实表征了疾病的活跃，CTCs 数量的增加预示着病情的恶化，可以通过 CTCs 了解原发性和转移性肿瘤，以 CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs 的可能促进肿瘤的临床研究。武汉友芝友生物制药有限公司2CTCs 在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对 CTCs 的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测 CTCs，其中有些已经成功
6、的用于测试或者临床评估。本文主要综述 CTCs 的富集和检测技术的研究进展，以及对 CTCs 的在临床分析和研究上应用。1 CTCs 富集技术为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的 CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠， 、快速， 、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的 CTCs 要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变 CTCs 的状态和表型7。CTCs 富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分
7、离方法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs 的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。1.1 免疫亲和性(Immunoaffinity)以免疫亲和性为基础的 CTCs 富集主要是利用捕获抗体(如 EpCAM 抗体)和 CTCs 靶抗原(如 EpCAM)之间的高度特异性。基于 EpCAM 抗体的富集技术有很多种，主要区别在于捕获的方法有所不同。抗体捕获的方法主要有以下几种。1.1.1 免疫磁珠法(Magnetic beads)免疫磁珠法富集 CTCs 主要是利用捕获抗体(如 EpCAM 抗体)和 CTCs 抗原(如 EpCAM)之间的高度特异性反应，免
8、疫作用促使抗原与耦合到磁珠的抗体发生特异性的结合，然后抗原- 抗体复合物被置于磁场作用之下，通过磁场对磁珠固定从而使 CTCs 与其他血液细胞分离，产生富集效果。Cell Search 系统是免疫磁珠方法应用的典型代表。在该方法中，经过密度梯度离心富集的外周血被收集到含有防凝剂的收集管中，然后被放置到一个自动化的制备系统。该系统利用免疫磁珠富集 EpCAM 阳性的细胞。捕获效率主要与 EpCAM 的表达水平有关。有研究表明在 EpCAM 高表达的细胞中，有大约 75%的捕获效率，而在 EpCAM 低表达的细胞中，大概只有 42%的表达捕获 效率。在检测的过程中，富集的细胞与 CD45，CK 的
9、抗体孵育，然后用 DAPI 染色。CK 和 CD45 分别用 PE 和 APC 荧光标记，然后，EpCAM 阳性的 CTCs 被 anti-ck-PE 抗体标记，而白细胞被 anti-CD45-APC 抗体标记。标记的细胞被CellTrack Analyzer 计数和分析，最终，CTCs 是 CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是 CK-/DAPI+/CD45+。系统的这种半自动特征使得样本的检测非常迅速，而且具有很好的重复性8。磁铁清扫装置(magnetic sweeper device)是新开发出来的技术，磁铁清扫装置提高被磁武汉友芝友生物制药有限公司3珠包被的 EpCAM 抗体的捕获
10、能力。这种技术的可以达到 62%的捕获效率，51% 的纯度，9ml/L 的通量9。用这种磁珠清扫设备用 RT-PCR 的方法从 30 个转移性乳腺癌病人中的21 个病人的血液中检测出了 CTCs10。磁性筛装置(magnetic sifter device)，通过微阵列的形式在磁场孔边缘产生极高的磁性区域，在富集过程中使用垂直流动构造，可以增强捕获效率到 91.4%，提高了处理速度，最优达到 10ml/h11。AdnaTest(Adnagen AG， Langenhagen， Germany)是一个商业化的设备，它采用了磁珠与各种癌症(如乳腺癌，直结肠癌，前列腺癌，卵巢癌 )的特异性抗体进行鸡
11、尾酒式结合，并用多重 RT-PCR 的方式检测 CTCs，这套实验装置已经真是可用于转移性乳腺癌，卵巢癌。比较研究发现，Adna Test breast cancer 装置从 55 个转移性乳腺癌病人中的 29 个病人血液中检测出了 CTCs，而 Cell Search 装置只从 26 个检测出了 CTCs12。Fig 1 Cell Search 富集检测 CTCs 流程1.1.2CTC-chipCTC-chip 是一种基于免疫亲和以及芯片的 CTCs 检测技术，在 970mm2 的表面上，排列了 78000 个被 EpCAM 抗体包被的硅微柱，用于捕获 CTCs。通过抽气产生压力使血液样品以
12、 1-2ml/h 的速度不间断的从芯片表面通过。这种缓慢的流速可以保证 CTCs 吸附在EpCAM 包被的微处理器上。而这种硅微柱提供了大量的表面积用于接触，从而使 EpCAM表达高或者低的 CTCs 的捕获效率差别不大，捕获效率超过 60%，纯度大约 50%。用癌症患者和健康人体的血液样品经过 CTCs-chip 检测，从 116 个患者中的 115 个患者身上检测到了 CTCs，而 20 个健康人体没有检测到 CTCs，敏感性达到了 99.1%，特异性为 100%。同时，检测到的 CTCs 数目与病人的病情相关13。一种类似的微柱是在”geometrically enhanced diff
13、erential immunocapture”微芯片上连接前列腺特异性膜抗原(PSMA)，这种微芯片的捕获效率为 85%，纯度为 68%，并且从 20 个前列腺病人中的 18 个检测到了 CTCs14。武汉友芝友生物制药有限公司4最近，Ozkumur 等开发了”CTC-iChip”，该装置可以用于以阳性 EpCAM 抗体的 CTCs筛选，也可以用于以大小为基础的富集步骤后对白细胞的消除。据报道，他们的捕获效率达到了 98.6%，纯度为 0.02-42%。CONG 42 个转移性癌症病人中的 37 个身上检测出了CTCs，而 Cell Research 仅从 29 个病人身上检测到 CTCs15
14、。Fig 2 CTC-chip 富集检测 CTCs 流程1.1.3 纳米结构底物(Nanostructured substrate)Wang 等利用纳米结构底物，以非常高的接触比表面积进行免疫亲和，用 EpCAM 抗体结合纳米柱，获得捕获效率 95%，通量为 1ml/h。用这个方法从 26 个前列腺癌中的 20 个病人身上检测到了 CTCs16。该芯片又被进一步修饰为以静电聚合物纳米纤维为底物，并与激光捕获显微切割联用，分离单个前列腺癌症 CTCs，然后可用于扩增或全基因组测序17。Fig 3 纳米结构底物富集 CTCs 流程1.1.4 微纤维(Microtubes)Hughes 等用仿生的方
15、法模拟血管选择素接到的细胞粘附过程进行 CTCs 捕获。选择素武汉友芝友生物制药有限公司5包被的围观外观？诱导细胞附着和卷曲，促进 CTCs 与抗 EpVAMEpCAM 抗体和 PSMA 抗体，在 4.8ml/h，这个装置的捕获效率为 50%，纯度为 66%，并且从 14 个测试病人的血样中全部能够检测到 CTCs，而 Cell Search 中质中只检测到 9 个18。1.1.5 体内采样(In vivo sampling)Saucedo-Zeni 等开发了一种体内采样的方法，将医学导线与 EpCAM 抗体连接，医疗导线通过插管注射到患者静脉 30 分钟，以润徐允许大体积的血液(1.5-3L
16、)直接连续采样。这个方法成功的在 24 个乳腺癌或者肺癌病人中的 22 个病人身上腹肌富集到了 CTCs19。1.1.6 白细胞消除(Leukocyte depletion)使用白细胞抗原(如 CD45，CD14 等)的单克隆抗体，以减少造血起源的细胞 。一些策略包括抗体标记白细胞标记，通过免疫磁珠分离去除白细胞，这些方法都能够有很好的恢复率和对 CTCs 的最小干扰，但可能降低样品的纯度20。1.1.7 小结抗原-抗体反应的特异性是使 CTCs 的分离具有非常高水平的特异性。然而，CTCs 的富集结果将严重依赖于所实用使用的特定抗体的性能。目前还有没已知的理想 CTCs 抗原靶，点可已可以将
17、所有的 CTCs 捕获而对所有的造血细胞排斥 。最近的报告表明，抗EpCAM 的方法可能错过不表现上皮表型的 CTCs，这可能由于 EMT 和 EpCAM 在一些上皮细胞 CTCs 的可变表达21。使用鸡尾酒式的抗体组合，可能会增加捕获效率，但也可能会降低特异性和样品的纯度。白细胞消除方法的好处是在分离过程中不会干扰 CTCs 的表型，但也可能会使附着在白细胞或者与白细胞相互作用的 CTCs 丢失。白细胞消除法会导致 CTCs 的纯度比阳性免疫亲和方法获得的 CTCs 纯度降低。一般来讲，免疫亲和方法需要长时间的孵育和反应时间，来富集更多地 CTCs，这也可能成为加快速度的瓶颈 。对于用阳性筛
18、选的免疫亲和方法而言，将 CTCs 从免疫亲和标签上分开也可能是个挑战 。1.2 物理特征物理特征也可用于有效的地将 CTCs 从外周血中分离出来 。以下的一些技术主要是利用 CTCs 与其他细胞在密度， 、大小， 、变形性和电离特征 等方面的差异进行分离的。1.2.1 密度梯度离心(Density gradient centrifugation)密度梯度离心是一种分离 CTCs 的低成本有效的方式，依据密度的不同可以把单核细胞从血液中的红细胞和粒细胞中分离出来。Weitz 等使用聚蔗糖溶液的密度梯度离心来分离 CTCs，用 RT-PCR 方法检测 CK20 的表达，发现在 1ml 血液中有
19、1 个 CTCs，并且在 58个结直肠癌患者中的 24 个患者血液中检测出了 CTCs22。OncoQuick 是一种将密度梯度离心和按大小分离结合的一种技术。Muller 等使用武汉友芝友生物制药有限公司6OncoQuick 从 5/60 的原发性乳腺癌患者血液中，25/63 的乳腺癌患者中检测到了 CTCs23。1.2.2 微孔过滤(Microfiltration)微孔过滤的原理是，让小的红细胞白细胞通过微孔，而稍大的 CTCs 被阻挡不能通过。Vona 等开发了 ISET 技术，该技术使用了中间有 8m 直径的圆孔的随机径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，用于 CTCs 的富集和细胞检测。这种有微孔
20、的滤膜比 Cell Search 设备更加敏感，使用微孔过滤从 57/60 转移性乳腺癌病人身上检测到了 CTCs，而使用 Cell Search 只从42/60 的转移性乳腺癌病人身上检测到了 CTCs24。zheng 等改进了这种微孔滤膜，他使用对二甲苯聚合物制成了圆形或椭圆的微孔滤膜使捕获效率提高到了 89%25。这种对聚二甲苯滤膜从 51/57 的癌症患者身上检测到CTCs，而用 CellSearch 技术只从 26/57 的癌症换证身上检测到 CTCs。Zheng 等接着研发了 3D 的微孔滤膜，包含了两层的聚对二甲苯，同时在顶部和底部层具有微制造限定的孔，这两个层之间的空隙，通过光
21、刻精确限定。这个装置的而重要特征就是，底部膜的孔位置从顶膜孔的位置偏移，如果肿瘤细胞被截留在顶部膜的孔，底部的膜可以提供直接反作用力，减少张力对 CTCs 细胞膜的作用，张力的减少适用于细胞进入孔的动态过程。每个滤膜片具有上面 36 个 9m 直径的孔，底部 37 个 8m 直径的孔。它还通过在顶部和底部膜形成的间隙允许更小的细胞通过的同时阻断大细胞，这样可以有效的充当过滤过程中的第三临界尺寸，确保对 CTCs 富集的高效率高纯度 26。Fig 4 3D Microfiltration 技术富集 CTCs 示意图1.2.3 微流体(microfluidics)微流体装置是以大小和变形性为基础的
22、富集 CTCs 的方法 。Tan 等设计了有 5 微米缝隙宽度的月牙形陷阱阵列，从血液中富集 CTCs，捕获效率和纯度都达到了 80%以上。这种微型装置成功的从转移性肺癌患者的 1-3ml 的血液中检测到了 CTCs27。更高通量的微流体运用惯性流分离的水动力去选择不同大小的细胞，原理是通过制定收缩和膨胀的微水池检测 CTCs。这些装置极大地提高了通量，并且能够处理较大体积的样品，但也可能降低白细胞中的 CTCs 的富集和回收效率28。Sun 等开发了双螺旋微流体通道流体动力学使武汉友芝友生物制药有限公司7用拖拽力分离 CTCs，能从稀释的血液中富集到 88.5%的 CTCs29。1.2.4
23、电场流分离(Dielectrophoresis)CTCs 的带电特性可被利用来从血液中分离，通过电泳现象施加一个非均匀电场。Becker 等利用叉指金电极分离白血病和乳腺癌细胞。由电极产生的电场由阳极吸引肿瘤细胞，而其他细胞会流过。除去电厂电场的肿瘤细胞可以被富集，捕获效率可以达到 95%30。Gupta 等开发了 ApoStream 仪器，从血液中捕获 CTCs 的效率大于 70%31。Fig 5 ApoStream 富集 CTCs 流程示意图1.2.5 小结利用物理特征分离 CTCs 的方法简单易行，并且不受 CTCs 表面抗原表达的影响。因此，他们不容易被抗原表达的变化或者由于 EMT
24、导致的表面生物标志的缺失影响，并且捕获效率常常大于 80%。密度梯度离心是一个强大的技术，作为富集的第一步非常有效。白细胞消除分离是一种很有前途又较为侵入性的方法，允许更多地血液采样，提高患者的检测灵敏度。密度梯度离心法的 CTCs 纯度不足，需要进一步的富集纯化，否则会影响下游的继续分析。微孔过滤法能够实现高通量的富集，能够在几分钟内处理满管的血液。但是 CTCs 与大的白细胞之间存在大小分布重叠，是富集分离样品的纯度低于 10%，此外，较小的 CTCs 或 CTCs 片段可能会漏掉。改进的微流体方法是获得 CTCs 的纯度超过80%，但同时也会是通量降低到 1ml/h。用水力驱动的微流体管
25、可能能够实现高通量，但同时也会降低捕获效率或纯度。应用电泳的 DEP 技术是一种比较新颖的技术，获取的 CTCs活力很强，也不会影响对 CTCs 的捕获。但 DEP 技术还没有在临床上进行彻底的评估，因此其临床利用价值还需要进一步的评估。1.3 直接分析另一种分离稀少的 CTCs 的方法是对血液中的全部细胞实现高通量的分析 。武汉友芝友生物制药有限公司81.3.1 光纤阵列扫描(Fiber-optic array scanning)Krivacic 等开发了一种高通量的“光纤阵列扫描技术” ，能够每秒分析 300000 个细胞32。血液首先处理使红细胞裂解，然后将所有剩下的细胞铺在载玻片上。红
26、细胞裂解主要是使用红细胞裂解缓冲液(ELB)，主要成为有 NH4Cl，KHCO3 和 EDTA 等。光纤阵列扫描技术已经被证实能够有效地计数乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌和卵巢癌的 CTCs。1.3.2 微霍尔效应传感器(Micro-Hall sensor)Issadore 等应用微霍尔效应传感器检测 CTCs，通量可以达到大约每分钟 107 个细胞。CTCs 可以纳米磁珠标记连接各种感兴趣的抗体(如 EpCAM，HER2，EGFR，MUC1)，接着从有传感器阵列的表面流过，传感器阵列可以测量由每一个标记细胞的磁流诱导产生的霍尔电压。这种技术已经被证实比 Cell Search 系统的敏感性更
27、好33。1.3.3 小结通过直接分析检测 CTCs 只需要对红细胞裂解，不需要对血液中的 CTCs 进行富集，减少了富集中的细胞损失。光纤扫描可以通过高质量图像和光学分析对 CTCs 进行有效检测。简单的芯片上的利用霍尔效应的电子检测并不需要光学仪器，因此具有便携性和个人护理的巨大潜力，不过该方法仅仅只能用于对 CTCs 进行计数 。2 CTCs 检测经过富集分离的 CTCs 还需要进一步的检测，常用的检测方法主要分为免疫检测和分子检测两种。2.1 免疫检测 2.1.1 免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)免疫组织化学技术是利用显色剂标记的单克隆抗体与肿瘤细胞上的抗原结
28、合并使其显色， 进而对肿瘤细胞进行定位定量定性分析。Sloane等1980年首次采用ICC方法检测乳腺癌患者骨髓中瘤细胞34。上述CellSearch 系统和CTCs-chip富集CTCs后的检测即为免疫组织化学检测。其过程为富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。尽管一些用于 CTCs捕获的抗体也能用于不同的癌症类型的免疫检测，如EpCA
29、M用于乳腺癌，肺癌，结直肠癌和其他的表皮肿瘤，癌症特异性的抗体也可能会适用，如PSMA或PSA用于前列腺癌检测。免疫组织化学方法的优点是简便，直观，肿瘤细胞未被破坏，可以进行后续形态学鉴别或核酸特征分析。 2.1.2 上皮细胞免疫斑点技术(Epithelial immunospot，EPISPOT)武汉友芝友生物制药有限公司9EPISPOT 是一种基于抗体的方法对活的 CTCs 进行量化检测。其基本流程是，富集的CTCs 在培养基中能够分泌特异性蛋白，使用荧光标记的分泌蛋白抗体，与 CTCs 孵育，使抗体与蛋白特异性结合，然后将孵育的液体平铺在载玻片上，通过荧光显微镜观察，每个斑点就代表一个
30、CTCs35。Alix-Panabires C 等通过免疫磁珠去除 CD45+细胞，再通过CXCR4+细胞富集 CTCs 后，用 EPISPOT 检测乳腺癌 CTCs 释放的特异蛋白质，如cathepsin-D(半胱氨酸蛋白酶) 和 Mucin-1，检测到的 CTCs 具有转移潜能。EPISPOT 以Mucin-1 和 CK19 作标志物检测乳腺癌 CTCs，表现出较高的敏感性和特异性36。Fig4 EPISPOT 检测 CTCs 流程示意图2.1.3 流式细胞术(Flow cytometry)流式细胞技术是在CTCs经过富集后，运用标记荧光物质的单克隆抗体与 CTCs特异性的标志物结合，使C
31、TCs染色，然后用流式细胞仪进行测量分析 。流失细胞技术的优点主要是可以再免疫放大检测CTC的 s同时对CTCS的形态进行定量测定，而且测量速度迅速，检测数据较精确。流式细胞技术还可以进行多参数测量，并对细胞进行分析与分选。最近几年已经有多种改进的流式细胞仪用于CTCs测定，例如光声流式细胞仪 37，光热流式细胞仪38 ，多色流式细胞仪39，光纤多光子流式细胞仪40，多参数流式细胞仪41。Watanabe 等研制了一种以流式细胞仪为基础的细胞捕获平台，利用On-chip 技术，组成了一种新颖的配备了一次性微流控芯片的流式细胞仪，能够对血液中的循环肿瘤细胞进行检测，捕获和分子特性分析 42。2.
32、2 分子检测RT-PCR 是 CTCs 分子检测中应用最广泛的技术。RT-PCR 检测 CTCs 是基于组织或肿武汉友芝友生物制药有限公司10瘤特异性 mRNA 的表达或某些基因改变后 DNA 水平的异常， 这些 mRNA 不表达于正常外周血细胞， 所以在外周血中检测到特异 mRNA 可以间接提示 CTCs 的存在。为了提高准确度，一般会同时检测几个标志物。这种技术的敏感性能够达到 1-10 个 CTCs/ml 血液，相当于从每 106-107 个外周血细胞有 1-10CTCs 即可被检测出来42。在目标基因被 RT-PCR扩增以后，可以通过凝胶电泳和 southern 杂交进行半定量分析，样
33、品也可以与健康对照衡量目的基因的表达水平，建立临界值。另外 ELISA 法也可以与 RT-PCR 联用，与凝胶电泳相比，可以提高检测的灵敏度，并且 PCR 产物可以半定量光学检测43 。近年来，人们又发展出巢式 PCR，荧光定量 RT-PCR 等技术，提高了检测的敏感度和特异性，而且可以对样本进行定量分析。荧光定量 RT-PCR 可以对 mRNA 的拷贝数进行定量。荧光定量 RT-PCR 也比 RT-PCR 更加敏感，可以在 107-108 个单核细胞中检测到 1 个CTCs44。3 CTCs 的临床应用分析现在已经开发了很多分析方法，分析 CTCs 的细胞和分子特征，以开发 CTCs 的在临
34、床疗效上的潜在影响。这些分析方法与 CTCs 的富集技术相结合，因为每个下游的应用都会对 CTCs 有自己的要求，比如敏感性，样品纯度，细胞活力，浓缩后恢复细胞的能力。不同的分离技术可能会更适合下游的特殊应用。在医疗样品中，通常建立一种新的方法是和 CellResearch 结果进行比较。3.1 免疫表型分析(Immunophenotyping) 免疫组织化学染色是 CTCs 检测和计数的标准技术，这种标准由 FDA 批准的CellSearch 系统树立。这种检定 CTCs 的标准包括:(1)CK 的阳性表达;(2)白细胞抗原 CD45的阴性表达;(3) 细胞核的阳性染色。癌症特异性的标记也可
35、以用来阳性 CTCs 鉴定，比如在前列腺癌中使用 PSA 或者 PSMA。CTCs 的免疫表型可以直接用于临床医疗，直接影响治疗选择。通过检测 CTCs 的数目，可以判断患者的病情45。3.2 检测基因拷贝数变化在很多的癌症患者的癌症相关基因拷贝数发生了变化，可以通过 FISH 的方法来检测。Meng 等利用 FISH 技术分析了乳腺癌患者的 CTCs 的致癌基因 HER2 的拷贝数，发现在原发肿瘤和 CTCs 中，HER2 存在一定的非一致性46。用 IF 技术和 RT-PCR 技术的研究也证实了这一情况。这表明，一个 HER2 阴性疾病的癌症患者经过一定的过程后，CTCs 可能发展成 HE
36、R2 阳性。CTCs 分析提供了一个通过微创途径反复筛选染色体异常的途径 。有趣的是，CTCs 的 HER2 扩增的筛选已经成功的应用于原发性乳腺癌患者 。3.3 检测致癌基因转移致癌基因的转移也是一种重要的癌症的致病机制。TMRPSS2-ERG 的转移发生在 30-70%的前列腺癌患者身上。运用 FISH 技术分析 CTCs，在 CTCs 中检测出了 TMRRSS2-武汉友芝友生物制药有限公司11ERG 融合47。在最近的研究中，应用 FISH 技术，在非小细胞肺癌患者 CTCs 中检测到了ALK 基因重排48 。3.4 致癌基因突变分析富集分离 CTCs 的一个主要应用就是检测致癌基因的突
37、变 。致癌基因的突变，常常用来预测肿瘤的恶化，疾病的发病原因，预测药物的敏感性。使用微芯片分离的 CTCs，运用位点特异性的 PCR 技术可以有效地检测到 EGFR 的突变49 。这种 EGRF T90M 突变赋予的药物抗性，也在接受 EGFR 激酶抑制剂的患者身上检测到了。等位特异性的 PCR 是一种快速和低成本的方法检测特定的基因突变。对于致病基因的突变，可以从 CTCs 的基因组 DNA 或者 cDNA 中扩增致病基因，并进行测序。Gasch 等运用全基因组扩增和突变特异性 PCR 方法从结直肠癌患者的 CTCs 中检测到了 KRAS 和 PIK3CA 基因的突变50 。3.5 基因组分
38、析现在已经开发了单细胞基因组测序技术，可以通过对 CTCs 基因组的测序，与正常细胞对比，分析 CTCs 基因组的基因突变，基因缺失，基因拷贝数变化，基因的转移等 。单一的 CTCs 的测序 可能彻底改变我们队转移性癌症的认识，提高临床护理的潜力 。3.6 CTCs 基因表达谱分析通过对 CTCs 表达谱分析，可以找到 CTCs 中特异表达基因，可以进一步应用于 CTCs临床检测和癌症发病机理等研究。Smirnov 等从一个转移性结直肠癌，一个转移性前列腺癌，一个转移性乳腺癌患血液里，富集超过 100 个 CTCs，通过对 CTCs 富集的样品 RNA和 CTCs 消除的样品 RNA 进行表达
39、谱分析，找到了一系列癌症特异性基因，CTCs 特异性基因，并通过进一步的验证，确定 AGR2，FABP1 等对于 CTCs 检测具有重要作用51 。Powell 等用生物标记数字 PCR(BioMark digital PCR)对免疫富集后的单个 CTCs 的基因表达，表达谱表明，CTCs 间存在高度的异质性，同时也发现了转移性乳腺癌和乳腺癌细胞系之间存在较小的一致性。3.7 RNA 测序Yu 等用微流体芯片分离了胰腺癌患者的 CTCs，然后用 RNAseq 技术对单个 CTCs 进行了 RNA 测序，测序结果表明，在 CTCs 中，WNT 通路信号激活，而这种信号可能是导致肿瘤转移的原因52
40、。4 总结癌症是世界上三大死亡率最多的疾病之一。CTCs检测的价值已经在乳腺癌 前列腺癌结直肠癌 Error! Reference source not found.中被证实，除此之外，在肺癌胃癌膀胱癌等肿瘤中CTCs检测的工作也在开展。Cell Search是目前唯一被FDA批准商业应用的体外CTCs检测设备。经过多年的研究发展，人们逐渐开发了多种CTCs的富集和检测技术，这为研制新的 CTCs武汉友芝友生物制药有限公司12检测设备，更好的研究应用CTCs提供了巨大的技术支持。有了这些技术积累，在不远的将来，必然会有更多的CTCs检测设备会研制成功，投入商业应用，从而 可以帮助人们更好的进行
41、早期临床诊断，判断患者预后评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗。参考文献1 Hanahan, D,Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell.2011, 144:646674.2 Ashworth, T. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Aust Med J .1869,14: 1461493 Thiery, J. P. Epithelialmes
42、enchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer 2002,2:4424544 Hayes, D. F., Cristofanilli, M., Budd, G. T., Ellis, M. J., Stopeck, A., Miller, M. C., et al.Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free an
43、d overall survival. Clin Cancer Res. 2006,12: 42184224.5 Danila, D. C., Heller, G., Gignac, G. A., Gonzalez-Espinoza, R., Anand, A., Tanaka, E., et al. Circulating tumor cell number and prognosis in progressive castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 2007,13:70537058.6 Cohen, S. J., P
44、unt, C. J., Iannotti, N., Saidman, B. H., Sabbath, K. D., Gabrail, N. Y., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol.2008, 26:32133221.7 Alix-Panabires C, Pantel K.Techn
45、ologies for detection of circulating tumor cells: facts and vision.Lab Chip. 2014 ,14(1):57-62.8 Riethdorf S1, Fritsche H, Mller V, Rau T, Schindlbeck C, Rack B, Janni W, Coith C, Beck K, Jnicke F, Jackson S, Gornet T, Cristofanilli M, Pantel K.Detection of circulating tumor cells in peripheral bloo
46、d of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the Cell Search system.Clin Cancer Res. 2007,13(3):920-928.9 Talasaz, A. H., Powell, A. A., Huber, D. E., Berbee, J. G., Roh, K. -H., Yu, W., et al. Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare
47、 cells from blood using a magnetic sweeper device. Proc Natl Acad Sci. 2009,106:39703975.武汉友芝友生物制药有限公司1310 Powell, A. A., Talasaz, A. H., Zhang, H., Coram, M.A., Reddy, A., Deng, G., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast canc
48、er cell lines. PLoS One.2012,7(5): e33788.11 Earhart, C. M., Hughes, C. E., Gaster, R. S., Ooi, C. C.,Wilson, R. J., Zhou, L. Y., Humke, E.W.,Xu, L., Wong, D. J.,Willingham, S. B., et al. Isolation and mutational analysis of circulating tumor cells from lung cancer patients with magnetic sifters and
49、 biochips. 2014 ,14(1):78-88.12 Andreopoulou, E., Yang, L. Y., Rangel, K. M., Reuben, J. M., Hsu, L., Krishnamurthy, S., et al. Comparison of assay methods for detection of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: AdnaGen AdnaTest BreastCancer Select/Detect versus Veridex Cell Search system. Int J Cancer.2012, 130: 15901597.13 Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al.Isolation of ra
