1、 一 步 一 步 教 你 使 用 N C B I 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等 作者urbest 2007-8-1 苏州大学生命科学学院 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 2 最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用NCBI 的一些经历经验跟大家交流一下BCBI 的使用。希望大家都能发表自己的使用心得让我们共同进步 我分以下几个部分说一下NCBI 的使用 Part one 如何查找
2、基因序列、mRNA、Promoter Part two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列 Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列 Part four 如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性 特别感谢本版版主将这个帖子置顶 从发帖到现在很多战友对该帖给与了积极的关注在此向给我投票的以及想给我投票却暂时不能投票的各位战友表示真诚的感谢谢谢各位战友 请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充 First of all还是让我们从查找基因序列开始。 第 一 部 分 利 用 M a p v i e w e r 查
3、找 基 因 序 列 、 m R N A 序 列 、启 动 子 P r o m o t e r 下面以人的IL6白细胞介素6为例讲述一下具体的操作步骤 1打开Map viewer 页面网址为http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html 在search 的下拉菜单里选择物种for 后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示 2点击“GO”出现如下页面 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 3 3在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框在Gene前面的小方框里打勾然后点击Filter. 出现下图 说明一
4、下1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个是不同的部门做出来的经我验证序列有微小的差异但总体来说基本相同。尽管你分别点击后序列代码、序列代码等有所差异但碱基基本一致不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 4 4点击上述三条序列第一条序列即reference对应的“Genes seq“出现新的页面页面下方为 5点击上图出现的“Download/View Sequence/Evidence ”即下载查看序列等功能结果
5、如图所示 先对上面这张图做点简要的说明在Sequence Format序列输出格式后面是一个下拉式选择菜单默认的为FASTA 格式还有一个是GenBank 格式。我推荐大家选择GenBnak格式因为这个格式提供了很多该基因的信息而FASTA 格式只有基因序列。 6在 Sequence Format 后选择 GenBank然后点击下面的 Display目的基因的相关信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示网页较大只抓取一小部分以作示范 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 5 在上述打开的网页中你可以看到基因长度基因序列以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息。 你会看到: m
6、RNA join(35983678,38414031,50905203,59116057, 78038394) 这代表了从基因的3598 位开始就是转录区了即我们常说的mRNA 片断由于内含子的存在所以mRNA 在DNA 序列上分成了几段。 CDS join(36603678,38414031,50905203,59116057, 78037970) CDS 代表编码序列即蛋白编码区是从 3660 开始的ATG 由于剪接作用所以 CDS 区也是不连续的。 说到这里可能很多朋友都已经明白了promoter 即启动子区域在哪里了。但我还是再唠叨几句转录起始位点前面是基因的调控区启动子区没有明显的位
7、置定义大家也只是猜测它的大体位置如果你要研究 promoter 区的话建议你选择转录起始位点前的 2000个碱基进行研究一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话也可以只研究-1000 到0 这一千个碱基因为一般情况下启动子区的变异都在这个区域内。 这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了这种方法可能使用的人不是很多但我个人比较喜欢因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流让我们把NCBI 用的更好 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 6 第 二 部 分 如 何 查 找 连 续 的 m R N A 、 c D N A 、 蛋 白
8、 序 列 依然 以 人 类 的 I L 6 为 例 1进入NCBI 主页http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ 在search 后面选择Gene在for 后面填写需要查找的基因的名字。如图所示 点击“Go”出现以下界面 出现了很多基因序列在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的有些是别名Other Aliases与你的目的基因一致根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6 是标号为2 的序列。 2.1 查找cDNA 序列 2.1.1 点击Order cDNA clone, 出现目的页面如图所示 一
9、步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 7 2.1.2 点击Clone Sequence 后面的链接即可得到cDNA 序列。点击后如图所示只抓取其中一部分 2.2 查找mRNA、蛋白序列 回到步骤1 点击“Go”之后出现的页面点击目的基因的名字出现以下页面(只抓取一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 8 相关部分) 页面的下半部分即可以获取mRNA 和蛋白序列的部分 找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”它分为几个板块第一个“mRNA and Protein ”区可以让我们找到连续的编码mRNA 序列和蛋白序列。在mRNA a
10、nd Protein一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 9 下面有两个序列代码中间划有一个箭头 这代表了mRNA 序列和蛋白序列。分别点击就可以得到相应的序列页面。点击后如图所示mRNA 序列 蛋白序列如下 NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二个板块是Reference assembly它下面显示的是Genomic 点击Genomic 下面Reference assembly 对应的Genbank 或FASTA 即可出现编码的 DNA 序列注意只是编码序列其中包括内含子但一般没有 5非编码区。这一步就不做贴图演示了吧呵呵。 这样我们就可以
11、找到基因的 cDNA 序列、连续的编码 mRNA 序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA 序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。 如果大家有更好的方法欢迎发帖交流 友情提示在NCBI 里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息大家不妨好好看看可能会有令我们惊喜的收获 最后唠叨一句最近我实验比较忙只能在深夜发帖可能要过几天再发第三部分Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列希望“期待下集”的朋友可以理解。 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 10 第 三 部 分 运 用 S T S 查 找 已 经 公 布 的 引 物 序 列 STS序列标签位点Seque
12、nce Tagged Site 一段短的 DNA 序列200500 个碱基对 这种序列在染色体上只出现一次其位置和碱基顺序都是已知的。在 PCR 反应中可以检测处STS 来STS 适宜于作为人类基因组的一种地标据此可以判定DNA 的方向和特定序列的相对位置。 以上内容基本是STS 的定义我主张活学活用下面就介绍一下我个人用STS 数据库查找引物的一点经验。 还是使用人的IL6 基因为例呵呵 1 打开NCBI 主页在Search 后面的下拉菜单选择UniSTS在FOR 后面填写目的基因。 操作完毕如图所示 点击GO 以后出现以下页面 这是你会发现NCBI 又提供了很多序列下面我们还是要初步筛选我
13、们需要的序列。 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 11 2根据物种、目的阴物所在染色体的位置等选择相应序列可能不只一个 点击。 下面以点击第一个进入的画面为例。 你会发现这个页面直接就给出了引物序列PCR 之后的片段长度也是给了的247bp。下面还有很多相关的信息 3点击GeneBank Accession 后面的代码进入下一个页面。 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 12 啊前后引物都呈现在眼前了还有反应体系和反应条件其中 Primer A 是前引物序列Primer B 则是后引物序列并且给出了他们在 DNA 序列中的位置。有兴趣的朋友可以在序列中
14、找一下是可以找到的 不过要注意PCR 是双链扩增在序列中可以直接找到的是Primer A 的原序列 和 Primer B 的互补序列。 在步骤二里面我只点开了一个序列继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物不过这要你自己慢慢发掘了。 这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道实用程度不是很高但如果这里面恰好有你想P 的片段的话恭喜你这些引物都是很成熟的引物可以直接拿过来使用了。 如果想寻找引物大家可以查阅相关论文已经报道的引物我们为什么不用呢既省时间可靠性又强。 如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话那就自己设计吧建议使用Primer 5 和 Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了推荐两
15、个帖子给大家看一下第一个是本版版主liuzeyi2002 发起的内容很丰富很值得学习另一个则是我发的。 http:/ http:/ 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 13 第 四 部 分 如 何 运 用 B L A S T 进 行 序 列 比 对 、 检 验 引 物 特异 性 提到序列比对绝大多数战友都会想到BLAST但BLAST 的使用确实又是一个很大的难题因为他的功能比较强悍里面涉及到的知识比较多而且比对结束后输出的结果参数指标又很多。如果把BLAST 的使用详细的都讲出来我想我发帖发到明天也发不完更何况我自己也不是完全懂得BLAST 的使用。所以我在这里也就“画龙点
16、睛”以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST 的使用也算是BLAST 的入门课程吧。请看帖的战友好好体会如果你用心看在看帖完毕之后 BLAST 的基本使用包括其他序列的比对应该没有问题了。 1打开BLAST 页面http:/www.n cbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 打开后如图所示 对上面这个页面进行一下必要的介绍 BLAST 的这个页面主体部分左面包括了三部分BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思我就不多说了我要说的是可以认为这是三种序列比对的方法或者说是BLAST 的三条
17、途径。 第一部分BLAST Assembled Genomes 就是让你选择你要比对的物种点击相应物种之后一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 14 即可进入比对页面。 第二部分Basic BLAST 包含了5 个常用的BLAST每一个都附有简短的介绍。 第三部分 Specialized BLAST 是一些特殊目的的 BLAST如 IgBLAST、SNP 等等这个时候你就需要在Specialized BLAST 部分做出适当的选择了。 总之这是一个导航页面它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST 途径。 下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST 的使用期间我也
18、会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。 2 点击Basic BLAST 部分的nucleotide blast 链接到一个新的页面。打开后如图所示 介绍一下上述页面 Enter Query Sequence 部分是让我们输入序列的你可以直接把序列粘贴进去也可以上传序列还可以选择你要比对的序列的范围留空就代表要比对你要输入的整个序列。Job Title 部分还可以为本次工作命一个名字。 Choose Search Set 部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类genome DNA 、mRNA 等等。如果是人或老鼠的话就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了这时候网页会主
19、动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框你可以分别选一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 15 择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。下面的 Entrez Query 可以对比对结果进行适当的限制。 Program Selection 部分其实是让我们选择本次比对的精确度种内种间等等。 在BLAST 按钮下面有一个“Algorithm parameters” 这是参数设置选项一般用户使用不到此项所以它比较隐蔽点击原网页下方即可增加了 Algorithm parameters 的内容。大部分战友都用不到更改这里面的选项我也不多说了有兴趣的朋友可以自己研究一下。 3依次填写上述
20、网页必须部分点击BLAST 按钮后出现如下界面只截取其中一部分 出现的这个结果页面信息含量非常大如果我们用心观察还是可以发现其中的一些主要指标的。列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。其中Description 部分推荐大家详细看一下另外说一下“E value” 这个指标与其他指标不同它的数值越小相似程度越高其他几个如Totle score都是数值越高相似度越高。 在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了还配合着各种参数的得分。 好了各位亲爱的战友我的BLAST 就发到这里为止了更具体的东西有待大家一起去努力研究。伴随着 BLAST 的终结我的“一步一步教你使用 NCBI”也要暂时告一段落了很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。以后如果我有新的NCBI 使用方法的话我还会添加到这里来但我想这一阵子是不会接着发了呵呵。 真心希望各位战友在这里一起交流自己使用NCBI 的一些技巧正如丁香园的宗旨一样“我为人人人人为我”让我们互相学习、共同进步最后再一次祝愿大家试验顺利 一步一步教你使用NCBI 苏州大学生命科学学院医学遗传 16 作者urbest 编排lzfist 苏州大学生命科学学院 本文章已在丁香园http:/网站发表
