1、-抗生素微生物检定法讲座 管碟法 基本原理 ： 一、管碟法测定抗生素效价原理 ： 管碟法测定效价 ，是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用 ，将已知效价的标准溶液与未知效价的供试品溶液 ，在同一条件下 ，在摊布高度敏感的特定试验菌的培养基上进行对照培养 ，经过一定时间后 ，抗生素在培养基内扩散到达适当范围产生了抑制试验菌生长的透明抑菌圈 。经比较标准液与供试品液两者产生抑菌圈直径或面积的大小 ，根据不同设计方法的计算原理 ，即可推算出供试品的效价 。 二、效价测定计算公式 二剂量法及其推导 ： 1、抑菌圈形成原理 ： 当小管内加入抗生素溶液后 ，即产生两种互动因素 ：一是抗生素溶液向培养基内呈球
2、面形扩散 ；另一种是试验菌开始生长 。抗生素在琼脂培养基内的浓度 ，随离开小管距离的增大而降低 ，离开小管愈远 ，琼脂培养基中抗生素浓度愈低 ，当抗生素扩散到一定时间 ，抗生素浓度高于最低抑菌浓度之处 ，试验菌的生长受到抑制 ，形成透明抑菌圈 ，圈之边缘处恰好为抗生素最低抑菌浓度 。 2、二剂量法公式推导 ： 管碟法球面扩散公式 ： r 2 4DTLnM/H - Lnc - Ln(4DT) 整理得 ：LogMr 2 /9.21DT + Logc4DTH 其中 ： D:扩散系数 r:抑菌圈半径 M:抗生素总数 T:扩散时间 c:最低抑菌浓度 H:培养基厚度 此公式即为直线方程 LogM bY +
3、 c 其中 : b 1/9.21DT ， c Logc4DTH 。 b为斜率 ， c 为截距 此公式为管碟法测定抗生素效价的基础 ，它表明对数剂量 LogM 与抑菌圈半径的平方成直线关系 ，这就是抗生素微生物效价检定法 (管碟法 )的理论依据 。 由公式 得： 1 标准品高剂量与抑菌圈关系式 ：LogM 2 S 2 2 + Logc4DTH 9.21DT 1 供试品高剂量与抑菌圈关系式 ：LogM 2/ T 2 2 + Logc4DTH 9.21DT 1 标准品低剂量与抑菌圈关系式 ：LogM 1 S 1 2 + Logc4DTH 9.21DT 1 供试品低剂量与抑菌圈关系式 ：LogM 1/
4、 T 1 2 + Logc4DTH 9.21DT 因标准品与供试品同质 ，最低抑菌浓度 c相同 ，又在同一双碟上培养 Logc4DTH相等 ，所以 -得： M2 1 Log Log ( T22 - S22) M2 9.21DT 其中 为供试品与标准品效价比率 。 同理可推算出低剂量反应式 ： M1 1 Log Log ( T12 - S12) M1 9.21DT 1 +得： 2Log (T 22- S22)+( T12 - S12) 9.21DT (+)-(+)得： (LogM 2+ LogM 2/)-( LogM 1 + LogM 1/) (S22+ T22- S12- T12) 9.21D
5、T 即 M 2 M 2/ 1 Log + Log (S22+ T22- S12- T12) M 1 M 1/ 9.21DT M2 M2 设 I 为高低剂量比的对数 。则 I Log Log M1 M1 1 2I (S22+ T22- S12- T12) 9.21DT Log T 22- S22+ T12- S12 /得 I S22+ T22- S12- T12 此为二剂量法效价计算公式 ，其中 S1、S 2、T 1、T 2分别为低浓度标准 、高浓度标准 、低浓度样品 、高浓度样品产生的抑菌圈半径 。 实验证明 ：对数剂量与抑菌圈直径或面积在一定条件下呈直线关系 ，所以为工作方便在实际工作中把半
6、径的平方改为抑菌圈直径或面积 ，公式变为 ： Log T 2- S2+ T1- S1 I S2+ T2- S1- T1 式中 ：供试品 与标准品的效价比率 ； T1低剂量供试品所致的抑菌圈直径的总和 ； T2高剂量供试品所致的抑菌圈直径的总和 ； S1低剂量标准品所致的抑菌圈直径的总和 ； S2高剂量标准品所致的抑菌圈直径的总和 ； I 高低剂量比的对数 。 此为工作中所用的二剂量法效价计算公式 。 三、一剂量法及其公式推倒 ： 管碟法操作条件的控制 一、抑菌圈圆正的控制 ： 在某些情况下 ，抑菌圈出现破裂 、不圆呈卵圆或椭圆形甚至 无圈现象 ，原因主要有 ： 滴样时药液飞溅 。此操作会导致抑
7、菌圈破裂 。防止方法是 ：毛细滴管内不得有气泡 ，毛细滴管口避免太细或太粗 ，毛细滴管离小钢管口距离不要太高 ，应适当调节 ，使液滴下滴时不致溅出 。另外 ，若发现有液滴溅出可用以下方法来补救 ：预先备好消毒小滤纸片 ，将溅在琼脂培养基表面的液滴用小滤纸片轻轻吸去 。 小钢管底部二端面不平 ，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈 。其原因是抗生素溶液在琼脂培养基上扩散速度不一致 。操作时使用加工相同的小钢管可防止此现象的发生 。 双碟 、小钢管或其它器具被抗 生素或其它杀菌剂污染 。此操作会使抑菌圈破裂 ，有时甚至使试验菌大部或全部被抑制 ，无法形成抑菌圈 。因此 ，操作时一定要防止材料 、器具
8、 、环境被抗生素污染 。 加菌层时培养基温度过高或受热时间过长 ，试验菌部分或全部被杀死 。此操作会使抑菌圈破裂 ，或形成的抑菌圈过大 ，有时甚至无圈 。一般情况下霉菌 、球菌不耐热 ，操作时应控制温度在 4550，同时培养基温度应均匀 ，防止局部过热使试验菌被烫死 。 小钢管之间的距离过小或形成的抑菌圈过大 ，可形成卵圆或椭圆形抑菌圈 。此现象的原因是相邻的小钢管之间的距离过小或形成的 抑菌圈过大 ，相邻两小钢管扩散的抗生素溶液互相叠加 ，超过该抗生素溶液对试验菌的最低抑菌浓度而形成卵圆或椭圆形抑菌圈 。防止方法有 ：使用钢管放置器安置钢管 ，使各钢管之间的距离均匀一致而避免过小 ；控制抑菌
9、圈大圈直径在 1822mm之间 。 培养温度不均匀 ，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈 。其原因是温度影响细菌的生长速度和抗生素在琼脂培养基内的扩散系数 ，双碟靠近热源较近处 ，细菌生长较快 ，形成的抑菌圈变成卵形而变小 。因此 ，为减少温度的影响 ，可采取以下措施 ：同批双碟放在同一层盘内 ；恒温箱中放入双碟后在培养过程 中不宜再开启 ；恒温室最好设计为正方形而且不宜过大 ，使用的加热设备尽量使室内温度均匀一致 。 双碟底部或工作台不够水平 。此操作会使培养基和菌层厚度不均匀 ，导致形成的抑菌圈不圆而且大小不均匀 。防止办法是 ：严格挑选使用底平的双碟 ，工作台用水平仪校正垫平 。 培养基
10、内有小凝块 。此操作会使形成的抑菌圈呈凹形而不圆 。其原因是抗生素溶液扩散到小凝块处扩散速度减慢 ，使形成的抑菌圈局部变小而呈凹形 。防止办法是 ：使用水浴锅融化培养基 ，保证培养基完全融化 ；防止培养基骤冷骤热 ，避免培养基中形成小凝块 。 所用的缓冲液 pH值和盐浓度的影响 。所用的缓冲液 pH 值和盐浓度不适宜会形成卵圆形抑菌圈 。例如 ，四环素类抗生素 ，当抗生素溶液的 pH 过低时形成的抑菌圈可呈卵圆形 。再如硫酸链霉素 ，如盐浓度太高或 pH 值过低 ，就会不显抑菌圈或呈向心型的卵圆形抑菌圈 ，比如稀释用缓冲液浓度如较药典规定浓度增大 10倍或缓冲液 pH 为6.0，则完全无抑菌圈
11、产生。其原因可能是当培养基内加入某些盐离子时使细菌减少抗生素接受器的效果 ，影响了抗生素对试验菌的最低抑菌浓度 。例如很多盐能对链霉素起拮抗作用 。因此 ，工作时应严格按照规定控制缓冲液和培养基的 pH 和盐浓度 ，减少其对测定的影响 。 二、抑菌圈大小的控制 ： 按照药典要求 ，抑菌圈大圈直径应控制在 1822mm之间 ，否则会增加测定误差 。 由公式 M C 0AL C 0V r2/4DT Ln C 0V - LnC4DTH (其中 M 为抗生素溶液 C0为抗生素溶液浓度 A 为面积 L 为钢管高度 V 为容积 ) 可知 ，抑菌圈大小可由公式中 A,L, C0,C,D,T,H 来控制 。控
12、制抑菌圈直径的方法主要有： 抑菌圈大小受 T 值增减 影响 ，若要使抑菌圈直径变小可预先培养一段时间再滴碟 ；若要使抑菌圈直径变大可滴碟后预先扩散一定时间再进行培养 。 可以通过改变培养基和缓冲液中的盐浓度来控制抑菌圈直径 。例如 ，新霉素和多粘菌素缓冲液中加入 3NaCl或培养基中加一定盐和吐温可改变扩散系数 D使抑菌圈增大 。 可以通过改变培养基的 pH 值来控制抑菌圈直径 。碱性抗生素在偏碱性培养基中抗菌效力强抑菌圈增大 ，酸性抗生素在偏酸性培养基中抗菌效力强抑菌圈增大 。例如 ，硫酸链霉素、乙酰螺旋霉素为碱性抗生素 ，形成的抑菌圈偏小 。因此 ，可通过提高培养基 pH 值至 8.08.
13、2 来提高抑菌圈直径 。 除温度 、扩散系数和抗生素溶液浓度外 ，培养基厚度也是影响抑菌圈直径的重要因素 。如将培养基厚度减小时 ，抑菌圈直径就增大 。薄层法就是根据此原理设计的 ，该法大大提高了试验的灵敏度 。 试验菌也是影响抑菌圈直径的一重要因素 。及时更换试验菌 ，使用新鲜菌液 ，可提高试验的灵敏度 ，增大抑菌圈直径 。例如 ，使用新开启的枯草芽孢杆菌测定乙酰螺旋霉素效价时形成的抑菌圈大圈直径比使用旧的试验菌 (2 年以上 )提高 12mm。 通过控制培养基中菌的浓度来控制抑菌圈直径 。例如 ，乙酰螺旋霉素 、泰乐菌素 、螺旋霉素形成的抑菌圈较小 ，为了提高抑菌圈直径 ，培养基中菌的浓度
14、为 0.10.2， 需要时还可以把原菌液稀释 35 倍。盐霉素 、麦白霉素形成的抑菌圈较大 ，为了降低抑菌圈直径，可以把菌液浓度提高至 23。 三、抑菌圈清晰度的控制 ： 造成抑菌圈边缘不清晰的主要原因是抑菌圈形成过程中扩散系统的纷乱 、不均一 ，不符合动力公式中各项之间的关系或为各种扩散系统交叉进行的结果 。 主要因素有 ： 检定菌放置时间过长 ，菌液中菌龄不一致 ，使抗生素溶液对不同菌龄的试验菌存在不同的最 低抑菌浓度 ，使形成的抑菌圈边缘不清晰 。应定期分离及时更换试验菌 ，使菌液中各试验菌菌龄一致 。 细菌生长时间不同 ，受温度 、湿度变化的影响或杂有易生长和不易生长的菌以至 T有 T
15、 1、T 2。 培养基内杂质影响扩散系统 ，使扩散系数形成两个 D1、D 2。因此 ，配制培养基时选用杂质少 、质量优的材料可提高抑菌圈清晰度 。例如 ，测定大观霉素效价 ，利用国产的酵母膏 、牛肉膏配制 时形成的抑菌圈特别不清晰 ，测定结果精密度和准确度很差 ，可信限率高 ，复试率高 。选用进口蛋白胨 、酵母粉 、牛肉粉配制的 ，测定大观霉素效价时形成 的抑菌圈比较清晰 ，测定结果稳定 ，可信限率和复试率低 。 抗生素中有杂质和其它组份使 C0或 M 发生变化 。例如麦白霉素是一多组份抗生素 ，形成的抑菌圈清晰度较差而且有双圈 。 抗生素杀菌 、抑菌的强弱 (本身的性质 )。抗生素对试验菌杀
16、菌作用或抑菌作用的强弱 ，能影响抑菌圈边缘清晰度 。杀菌型抗生素如链霉素 、硫酸庆大霉素形成的抑菌圈边缘光滑清晰。抑菌型抗生素如竹桃霉素 、春雷霉素对不少试验菌呈抑菌作用 ，抑菌圈边缘模糊或出现双圈 ，枯草杆菌经紫外光处理后得到的变异菌珠 (1-338)，对春雷霉素敏感度增高 ，能够获得较 清晰的抑菌圈 。再如 ，泰乐菌素对藤黄微球菌杀灭作用较弱 ，形成的抑菌圈边缘清晰度较差 ，对枯草芽孢杆菌杀灭作用较强 ，形成的抑菌圈边缘很清晰 。 解决办法有 ： 保持菌种新鲜 ，定期传代 ，及时更换 ，定时进行单菌落的分离 、纯化 。 增强抗生素的抗菌活性 ：可以从培养基的成分 、pH 值和缓冲液的 PH
17、值和浓度来控制 。 严格控制操作条件 ：如严格控制培养基 、缓冲液的 pH和培养温度的均匀性 。 操作技术 一、设备 、仪器 、用具及其要求 ： 设备 、仪器 、用具及其要求 ： 抑菌圈测量仪 ZY-300A 型： 直径重复测量精度差 0.2%：同一抑菌圈重复扫描 10次，10次测量结果相对标准偏差 0.2%。 台间测量差异 1%：不同台仪器之间测量差异 1%。 效价重复测量精密度 0.5%：同台仪器重复测量 5次，结果相对标准偏差 0.5%。 旋转精度 0.08mm：使用抑菌圈边缘特别清晰的双碟 ,从最上位置开始 ，每旋转 45测量抑菌圈直径一次 ，旋转一周共测 8次，8 次中最大直径与最小
18、直径之差应 0.08mm。 ZY-300型 同一位 置抑菌圈直径测量重复精度 ：使用标准模板 ，在同一位置反复测量 8 次，得到 4 组抑菌圈直径 ，记为 ds1、d t1、d s2、d t2，各组中最大值与最小值之差应 0.02mm。 不同位置抑菌圈直径测量精度 ：使用标准模板 ，在 16 #位置各测量 1 次，得到 4组抑菌圈直径 ，记为 ds1、d t1、d s2、d t2，各组中最大值与最小值之差应 0.05mm。 台间测量差异 0.5%：不同台仪器之间测量差异 0.5%。 效价重复测量精密度 0.3%：同台仪器重复测量结果相对标准偏差 0.3%。 超净工作台 ：用于菌种的接种和传代
19、。超净工作台须置万级洁净区或十万级洁净区内 。 电子天平 (万分之一或十万分之一 )。 钢管放置器 ：无菌 、无抗生素污染 。 电子数显卡尺 ：测量范围 0150mm，读数值 0.01mm。 容量瓶 25ml、50ml、100ml、200ml、250ml、500ml、1000ml，均为 A级品 。 刻度吸管 1ml、2ml、5ml、10ml、20ml，均为 A 级品 。 移液管 1ml、2ml、5ml、10ml、20ml，25ml，50ml，均为 A级品 。 小钢管 不锈钢小管 ，内径 6.00.1mm，外径 7.80.1mm，高 10.00.1mm，每个小钢管重量不得超过平均重量的 0.05
20、g，内外壁及两端面光洁平坦 ，管壁厚薄一致 。 平底双碟 内径 900.5mm，高 1617mm，平皿底面要求平坦光滑 ，厚薄均匀 ，无气泡 。新购双碟应进行碟底平度检查 ，可将双碟放在水平台上 ，下垫一张白纸 ，碟内加水 23ml，滴加蓝墨水 ，观察蓝色深浅是否一致 。 设备 、仪器 、用具的准备 ： 双碟 将用过的双碟先用自来水冲洗一遍 ，然后用洗涤液擦洗 ，再用自来水冲洗干净 ，用纯化水冲洗两次 ，置 150160干热灭菌两小时 ，取出备用 。一般在三日内使用 。 小钢管 将用过的小钢管 ，用 0.1%消毒液或 0.1%新洁尔灭浸泡消毒 2小时以上 ，进行灭菌后再进行洗涤 。先用自来水
21、、纯化水冲洗 ，再用超声波超声 30分钟 ，用自来水 、纯化水冲洗 ，再用纯化水煮沸 30分钟 ，置 150160干热灭菌两小时 ，取出备用 。每月用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁 ，自来水冲洗 ，再用纯化 水冲洗 3 次后 ，置带盖的容器内 ，置 150160干热灭菌两小时 ，取出备用 。 刻度吸管 、移液管 、容量瓶 依次用自来水冲洗 、洗涤液洗涤 ，再用自来水冲洗干净 ，最后用纯化水冲洗两遍 ，置室温自然干燥备用 。每周用洗液浸泡 2 小时洗涤一次 。 滴管 用自来水冲洗干净 ，用纯化水冲洗两遍 ，置 150160烘烤两小时取出备用 。每周用洗液浸泡 2小时洗涤一次 。 陶盖 、玻璃盖 每
22、月清洗一次 ，清洗时先用洗衣粉刷洗 ，然后用自来水冲净 ，再用纯化水冲洗两遍 ， 最后于 150160干热灭菌两小时 ，取出备用 。 钢管放置器 每月清洁消毒一次 ，清洁时用 75%酒精棉球擦拭 ，并用酒精棉烧小孔约 30 秒，备用 。 灭菌刻度吸管 (加菌液用 ) 用后浸泡于 2%来苏尔液中 ，清洗时取出 ，用自来水冲净 ，晾干 ，在洗液中浸泡两小时以上 ，然后取出 ，用自来水冲净 ，再用纯化水冲洗两遍 ，于 150160烘干 ，用少许脱脂棉堵吸管口 ，再用纸逐支包好 ，用牛皮纸包扎成捆 ，115灭菌 30 分钟 。 30万级洁净区 (半无菌室 )要求 ： 每天工作前先用消毒液擦操 作台面
23、、门、窗、地面 ，再开启紫外灯照射半小时后方可进入工作 。每周用消毒液进行一次卫生清理 ，包括墙面 ，并用 5%石炭酸溶液或 75%酒精溶液喷雾灭菌 。 工作人员进入洁净室要换上工作服及拖鞋 ，此工作服及拖鞋不得穿出洁净室并且每周至少清洗一次 ，拖鞋用后应用消毒液浸泡 。 洁净区内的工作人员一般不得超过 5 人，非本室工作人员禁止入内 ，进出时内外门不得同时打开 。 洁净室内使用的消毒液要交替使用 ，避免产生耐药菌珠 。 二、试验材料 ： .培养基 ： .基本要求 ： 选择适当的原材料 ：对原材料进行预先试验 ，挑选适当的牌号 、厂家使用 。 制成的培养基凝固后应透明 、无沉淀 。应先调节 p
24、H 再分装后灭菌 。葡萄糖和其它糖类应在过滤后加入 ，避免多次加热被破坏 。 调节 pH 时避免反复调节 。 分装培养基的容器应预先灭菌 。 配制好的培养基应储存在冷处 ，当月使用 。 .培养基的制备 ： 自配培养基 ：按配方要求称量各成分 ，除琼脂和葡萄糖外 ，混合上述成分加热溶解，溶解后用比色箱或酸度计调节 pH 使灭菌后在要求范围之内 ，分装至锥形瓶中 ，115灭菌 30分钟 。 半成品 (干粉 )培养基 ：按要求称取培养基至锥形瓶中 ，用酸度计调节蒸馏水 pH至适当范围 ，(消毒后培养基 pH在要求范围内 )，分装至锥形瓶中 ，115灭菌 30分钟 。 配制注意事项 含有葡萄糖的培养基
25、应在各成分加热溶解后再加入葡萄糖 ，其目的是防止葡萄糖加热被破坏 。 pH 的测定使用酸度计 ，使用 20%的氢氧化钠溶液或浓盐酸进行调整 。 配制的培养基必须调节 pH 值，pH 的调整按照各种培养基项下规定的方法进行 ，保证培养基 灭菌后其 pH值在要求范围之内 。 商品培养基或培养基主要原材料更换批号或生产厂家时进行 pH 值预试验 ，保证培养基灭菌后其 pH 值在要求范围之内 。 除另有规定外 ，培养基的使用期限为一个月 。 灭菌缓冲液 ： 基本要求 ： 所用化学药品规格不低于二级试剂 (AR)规格 。 配制后用耐酸滤过漏斗滤过沉淀 ，使溶液澄清 。 配制后灭菌保存 ，使用期限为一个月
26、 。 注意事项 ： 缓冲液配制后 ，用酸度计测定 pH，必要时可用磷酸 (18N)或氢氧化钾 (10N)溶液调节 pH使灭菌后在规定 pH的0.05。 菌种 ： 菌种保存 ： 检定用菌种为中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥管 ，放在 48冰箱保存 。 工作用菌种与传代用菌种置 48冰箱保存 。 冷冻干燥菌种管的开启方法 ： 将用具移入超净工作台上 ，开启紫外灯消毒 30分钟 用 75%的酒精消毒双手 、操作台和菌种管外壁 ，待干 。点燃酒精灯 ，将菌种管封口端在火焰上烧灼红热 ，用灭菌吸管吸取少量灭菌水滴至红热处 ，使菌种管炸裂 。 在火焰旁用灭菌镊子将炸裂的菌种管管口打开 ，另取一支灭菌吸
27、管 ，在火焰旁吸取少量灭菌水至菌种管 底部使菌种溶解 。消毒接种针 ，用接种针或灭菌吸管取少量菌液接种至规定空白琼脂斜面上 。 在各菌种规定温度下恒温培养 2224 小时 。仔细观察菌苔形态 、有无杂菌 ，涂片 ，革兰氏染色镜检呈典型菌落后转种 23代即可使用 ，放在 48冰箱保存备用 。 菌种的传代 、分离 ： 基本操作 ： 准备需用的培养基 ，培养基应新鲜制备 ，如斜面已无冷凝水则不宜再使用 。标签上注明菌名及接种日期 。自冰箱取出的菌种斜面应在室温放置 30 分钟 ，待温度平衡后再移入超净工作台上 。 将材料 、用具移入超净工作台上 ，开启紫外灯消毒 30分钟 。 用 75%的酒精消毒双
28、手 、操作台及接种针 ，点燃酒精灯 ，左手握住菌种斜面 ，将管口靠近火焰旁 ，右手拿接种针后端 ，将接种环烧红约 30 秒钟 ，随后将全部接种针金属部分在火焰上烧灼 ， 往返通过 3 次。右手用无名指 、小指及掌部夹住棉塞 ，左手将管口在火焰上旋转烧灼 ，右手再轻轻拔开棉塞 ，将接种环伸入菌种管内 ，先在近管壁的琼脂表面上靠一下，冷却后再刮取少量菌苔 ，取出接种针 ，在火焰旁迅速将菌种管棉塞堵上 ，把菌种管斜面放在超净工作台上 。左手迅速拿起一支未用过的培养基斜面 ，右手用无名指 、小指及掌部夹住并拔开棉塞 ，迅速将接种环伸 入管内至琼脂斜面底部 ，由底向上 ，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动
29、，使细菌划在琼脂斜面的表面上 。 取出接种针 ，在火焰旁将菌种管棉塞堵上 。接种 34 支菌种管或接种完毕后 ，将接种过细菌的接种针在火焰上烧灼灭菌 。 将接种过菌种的培养基置规定温度进行恒温培养 ，培养时间根据各菌种项下规定的时间确定 (见 4.菌悬液的制备 )，取出后放在 48冰箱保存备用 。 注意事项 ： 接种前后必须保证环境 、用具无菌无抗生素污染 。 接种针灼烧后刮取菌苔前先在近管壁的琼脂表面上靠一下再刮取菌苔 ，目的是防止菌种被灼热的接种针烫死 。 接种针灼烧消毒时 ，先将白金耳离沾有细菌远端的白金丝烧灼至红 ，使其传热到白金耳 ，把白金耳上的菌烫死后再将白金耳在火焰上烧灼至红约
30、30 秒，目的是防止活的细菌溅出污染环境 。 接种针每传 34支培养基烧灼消毒一次 。 操作应迅速 ，消毒应彻底 。 工作用菌种至少每月传代一次 ，工作用菌种至少每半年 (或 6 代)平板分离一次 ，挑选典型的单个菌落 。 菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)悬液 ： 取枯草 芽孢杆菌 CMCC(B) 63 501的营养琼脂斜面培养物 ，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中 ，在 3537培养 7天，用革兰氏染色法涂片镜检 ，应有芽孢 85%以上 。用灭菌水将芽孢洗下 ，在 65加热 30分钟 ，冰箱储存备用 。 短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)悬
31、液 ： 取短小芽孢杆菌 CMCC(B) 63 202的营养琼脂斜面培养物 ，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中 ，在 3537培养 7天，用革兰氏染色法涂片镜检 ，应有芽孢 85%以上 。用灭菌水将芽孢洗下 ，在 65加热 30分钟，冰箱储存备用 。 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)悬液 ： 取金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003的营养琼脂斜面培养物 ，接种于营养琼脂斜面上， 在 3537培养 2022小时 。临用时用灭菌水或 0.9%的灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下 ，冰箱储存备用 。 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)悬液 ： 取藤黄微球菌
32、 CMCC(B) 28 001 或ATCC 9341或 ATCC9341a的营养琼脂斜面培养物 ，接种于盛有营养琼脂培 养基的培养瓶中 ，在2627培养 24小时 ，或采用适当方法制备的菌斜面 ，临用时用 0.9%的灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下 ，冰箱储存备用 。 大肠杆菌 (Escherichia coli)悬液 ： 取大肠埃希氏菌 CMCC(B)44 103 或44102的营养琼脂斜面培养物 ，接种于营养琼脂斜面上 ，在 3537培养 2022 小时 。临用时用灭菌水将菌苔洗下 ，冰箱储存备用 。 肺炎克雷伯氏菌 (Klebosiella pneumoniae)悬液 ： 取肺炎克雷伯氏菌 CM
33、CC(B) 46 117的斜面培养物 ，接种于豆粉琼脂或营养琼脂斜面上 ，在 3537培养 2022小时 。临用时用灭菌水将菌苔洗下 ，冰箱储存备用 。 支气管炎博德特氏菌悬液 取支气管炎博德特氏菌 CMCC(B) 58403的斜面培养物 ，接种于专用菌种斜面培养基上，在 3537培养 2022 小时 。临用时用灭菌水将菌苔洗下 ，冰箱储存备用 。 常用菌悬液制备时所用溶剂 、保存方法及使用期限见表二 ： 表二 ：常用菌悬液制备时所用溶剂 、保存方法及使用期限 菌液名称 所用溶剂 保存方 法及使用期限 枯草芽孢杆菌 灭菌水 48冰箱保存 ，1个月 短小芽孢杆菌 灭菌水 48冰箱保存 ，1个月
34、金黄色葡萄球菌 灭菌水或 0.9%的灭菌氯化钠溶液 48冰箱保存 ， 7 天 藤黄微球菌 0.9%的灭菌氯化钠溶液 48冰箱保存 ，1个月 大肠埃希氏菌 灭菌水 48冰箱保存 ， 7 天 肺炎克雷伯氏菌 灭菌水 48冰箱保存 ，14 天 支气管炎博德特氏菌 灭菌水 48冰箱保存 ，14 天 常用试验用菌种的生物学特性 ： 枯草芽孢杆菌 ： 形态与染色 ：菌体细短棒状 ，单个或成链状 ，二端半圆形 ，染色均匀 。芽孢椭圆形或圆柱形 ，位于菌体中央 ，革兰氏染色阳性 ，能运动 。 培养特性 ： 肉汤琼脂平板 ：菌落表面粗糙 ，圆形 ，灰黄色 ，边缘锯齿状 ，分离时应挑选粗糙形菌落。 普通肉汤培养基
35、 ：呈少量浑浊并产生沉淀 ，在液体表面形成皱状厚膜 ，粘附于试管壁上 。 最适培养温度 3037，生长温度范围 1555，兼性嫌氧或需氧 。 抵抗力 ：菌体湿热 551 小时被杀死 ，芽孢 1003小时或 12040分钟被杀死 。 短小芽孢杆菌 ： 形态 与染色 ：杆状 ，革兰氏染色阳性 ，无荚膜 ，芽孢偏生 ，椭圆形 ，有动力 。 培养特性 ：平板分离时应挑选光滑形菌落 ，其它与枯草芽孢杆菌相似 。 藤黄微球菌 ： 形态与染色 ：球形 ，排列成立体状呈八叠 ，革兰氏染色阳性 。 培养特性 ： 肉汤琼脂平板菌落为黄色 ，圆形 ，光滑 ，凸出 ，表面湿润光亮 ，平板分离时应挑选光滑形菌落 。普通
36、肉汤呈黄色沉淀 ，很少浑浊 。 需氧菌 ，最适生长温度为 25。 金黄色葡萄球菌 ： 形态与染色 ：圆球形排列成典型的葡萄串状 ，肉汤琼脂平面培养多呈短链 状或双球状 ，无鞭毛 ，不能运动 ，不产生芽孢 ，革兰氏染色阳性 。 培养特性 ： 在 2838生长较好 ，pH 界为 4.59.8，pH7.4 左右生长最好 。平板分离时应挑选光滑形菌落 。 蜡样芽孢杆菌 ： 形态与染色 ：菌体杆状 ，常呈长链状 ，菌体两端略方形 ，革兰氏染色阳性 ，芽孢位于菌体中央 。 培养特性 ： 肉汤琼脂平板菌落为白色或淡黄色 ，较大 ，扁平 ，散布 。普通肉汤很厚 ，均匀浑浊 ，液体表面形成菌膜 。最适培养温度
37、30，需氧性 。 大肠杆菌 ： 形态与染色 ：短杆菌 ，两端钝圆 ，无芽孢 ，革兰氏染色阴性 。 培养特性 ：需氧菌也兼性厌氧 。 对检定菌的基本要求 ： 显示临床特点 ，对抗生素主要组分敏感 ，对杂质 、降压物质及毒性物质无作用或作用很低 。 灵敏 、稳定 ，抑菌圈边缘清晰 ，测定误差小 。 易于培养 、保存 ，无致病性 。 与其它各国药典的试验菌最好一致 ，便于单位统一 。 三、操作过程 ： 二剂量法测定效价操作过程主要包括以下七个部分 : .试验用菌液 、缓冲液 、培养基的制备 。 .标准品与供试品溶液的制备 。 .双碟的制备 。 .滴加钢管 。 .培养 。 .测量抑菌圈直径或面积 。
38、.计算结果及统计分析 。 整个操作过程可用下述流程图表示 ： 抗生素溶液的制备 ：按照各抗生素品种项下的要求配制抗生素溶液 ，滴碟备用 。 双碟的制备 ： 倒底层培养基 ： 将培养基于水浴或微波炉中加热融化 ，冷却至 6070。将双碟按编号平摆在水平操作台上 ，用灭菌大口吸管吸取培养基 20ml 于双碟内 ，使其在碟底均匀分布 ，等凝固后更换干燥的陶瓦盖 。同时用紫外光灯消毒洁净室 。 加菌层培养基 ： 将已经加热 融化的菌层培养基冷却至 4850(芽孢可至 60)，以无菌操作加入适量试验菌悬液 ，摇匀 ，用灭菌刻度吸管吸取菌层培养基 5ml，使均匀摊布在底层培养基上 ，置水平操作台上 ，用陶
39、瓦盖覆盖 ，放置 2030 分钟 ，待凝固 ，备用 。加菌液量 ，事先进行预测，二剂量法高浓度抑菌圈直径应控制在 1822mm 之间 ，三剂量法中心浓度的抑菌圈直径应控制在 1518mm之间 。 滴定和培养 ： 每批样品用九只双碟 ，用钢管放置器 ，二剂量法每碟安置四个小钢管 ，三剂量法每碟安置六个小钢管 滴加标准品与供试品溶液 ，因实验设计不同而异 。二剂量法 ，每碟中对角的两个小钢管分别滴加高 、低浓度的标准品溶液 ，其余两个小钢管分别滴加相应的高 、低两种浓度的样品溶液 。三剂量法的 6 个钢管中间隔 3 个钢管中分别滴加标准品及供试品高 （H）、 中（M）、低（L）3 种浓度的溶液 ，
40、并使相同浓度成对角 。滴加量以与小钢管口齐平为宜 ，各钢管加入量应尽量一致 。滴加溶液的顺序 ，二剂量法应按照 SHT HS LT L的顺序滴加 ；三剂量法应按照 SHT HS MT MS LT L的顺序滴加 。 滴加溶液的时间不可过长 ，一般二剂量法 ，九只双碟应在 3 分钟之内滴加完毕 。 滴碟完毕 ，将双碟以水平 方向搬至托盘上 ，并用陶瓦圆盖盖好 ，平稳地移入恒温室或恒温箱 ,在规定温度下培养至所需时间 。 结果计算 将培养好的双碟取出 ，倒出小钢管 ，测量前 ，应检查各抑菌圈是否圆整 ，如发现破圈或不圆整应弃之 。由仪器测量各抑菌圈的直径或面积 ，并按生物检定统计法进行可靠性测验 、
41、效价计算及可信限计算 。对于同一批样品多次测定结果应进行合并计算 ，参加合并计算的每组数据中各技术参数均应符合要求 ，合并计算结果应均一 ，参加合并计算的初试与复试组数应接近 。 技术标准 每批至少有六个双碟的结果 ，方可出报告 ，而且抑菌圈不得有一个破裂或不圆的情况 。 测得的效价 ，如低于估计效价 90%或高于 110%时，应调整估计效价 ，予以重试 。 可靠性测验应符合规定 ，否则不能计算效价和可信限率 。二剂量法回归项应非常显著(p0.05)；三剂量法 ，除二剂量法的规定外 ，尚考查二次曲线和反二次曲线 (p0.05)，具体规定见表三 表三 ： 可靠性测验技术标准 双碟数量 4 5 6
42、 7 8 9 10 回归项 10.56 9.49 8.68 8.33 8.05 7.88 7.72 偏离平行 5.12 4.79 4.54 4.43 4.33 4.28 4.22 除另有规定外 ,可信限率不得超过 5.0%。 依法对试验结果进行特异反应剔除 ， 剔除特异反应时应将特异双碟整个除去 。剔除特异双碟具体规定如下 ： 有明显特大 、特小圈均应去除 。 明显影响可信限率和 F3的双碟可去除 (去两碟后可信限率和 F3符合要求 )。 比平均值高或低 0.5mm，而本批碟子中又无低或高相同数目的双碟可去除 。 去除某双碟后结果增加或降低 1.2%以上 ，而本批碟子中又无使 结果降低或增加相
43、同数目的双碟可去除 。 操作要点 （操作注意事项 ） 一、环境要求 ： 无抗生素及微生物污染 ，半无菌室室温控制在 2030，操作台要平 ，培养温度均匀 361。 二、仪器 、用具 、材料要求 ： 效价检定所有材料用具无抗生素和微生物污染 。 所用计量器具均为一等品 ，玻璃容器内壁应清洁无油渍 。 同一批样品所用平皿内径最好相同 。 防止玻璃仪器对抗生素的吸附作用 。 不同次购买的钢管必须同时进行重量挑选 。 测量仪器应符合仪器技术指标要求 。 三、培养基 ： 配制的培养基必须调节 pH，保证灭菌后其 pH在药典规定的范围内 。 四、菌液要求 ： 所用试验菌符合要求 。 加菌量一般不超过 1，
44、 若加入量太多 ，则菌层培养基被稀释而变软使钢管下陷 。 菌液按照规定要求保存 。 按时进行传代 、分离 、更新 。 五、标准品的使用 ： 按照标准使用说明书使用 。 六、基本操作 ： 称量 ：要求快速准确称取样品 。 最好用十万分之一天平称取 ，称样量不得少于 20mg，若用万分之一天平称取 ，一般不少于 100mg。 称量前将标准品取出 ，放至室温 。 尽量快速称取 ，不得将已称取的标准样品放回原容器内 。 应经常检查校核天平 。 溶解稀释 ： 必须保证标准样品完全溶解 。 所用的计量器具必须标定均为一等品 ，稀释用容器为容量瓶 。 标准储备液与样品溶液温度相同时才能进行稀释 。 稀释步骤
45、不宜太多 ，一般不超过三步 。 稀释时尽量按照 “稀溶液大体积 ”的原则 ，即每次吸取量一般不少于 2.00ml。 稀释过程中防止玻璃仪器的吸附作用 。如吸管用被 吸液洗涤 23 次，容量瓶中预先加入部分缓冲液 。 稀释标准品与供试品所用缓冲液应用同批同瓶内的缓冲液并且同时进行 。 标准样品溶液同步稀释用同一支吸管吸取相同的体积 。 对需要进行多步稀释的样品 ，在稀释过程中一定要注意不要把上步高浓度溶液带入到下步低浓度溶液中 。例如 ，下步稀释不能用上步稀释用过的吸管和滤纸 ，洗滴头和吸管时不要把高浓度废液溅到吸管和滴头上 。 稀释后的溶液不要放置时间太长 。 双碟的制备和碟子的滴加和培养 ：
46、 保证操作台面水平 。 融化培养基应避免明火 ，培养基融化次数不宜太多 ，融化后的培养基应避免骤冷 ，以防止培养基中出现凝块 ，倒置底层前应把培养基摇匀 。 加菌层时带菌培养基一定要摇匀 ，注意不要产生气泡 ，摇碟子时要端平 、摇匀 、到边。 同一批样品尽量用内径相同的碟子 。 底层菌层的加入量尽量一致 。 从加底层完毕到加钢管的时间不超过 2030分钟为宜 。 滴碟子用的滴头在使用前用被滴液洗涤 23次。 加钢管时尽量使用钢管放置器 ，以保证每个钢管下落的高度均匀一致 ，钢管在培养基中下沉的程度相同 ，以保证各钢管中抗生素溶液的扩散速度相同 。 按照要求顺序滴加双碟 ，并且滴加双碟时尽量 “
47、快”、“匀”。 保证培养温度均匀一致 。 测量计算 ： 所用仪器必须符合仪器技术指标要求 。 抑菌圈必须圆整 ，如有破圈或不圆者应弃之 。 使用抑菌圈测量仪测量时 ，对比度一定要调整好 ，使抑菌圈边缘清晰 。 切忌主观挑选双碟 ，除个别双碟出现异常 (如破圈 、特大特小圈 )外，不得主观挑选双碟 ，应将全部双碟测量及计算结果 。 结果判断 ： 二剂量法双碟不得少于 6个，增加双碟数可降低误差 。 测定效价和估计效价相差超过 10时应重新调整估计效价 ，予以重试 。 可靠性测验 ：直线回归 、剂间 0.01，偏离平行 0.05 可信限率 ：一般 5。 二剂量法的要求及误差统计分析 ： 一、基本要求 ：
