1、Copyright 2012 JGC all rights reserved 日本生物制剂工厂设计经验分享 第四 届“弗戈制药工程国际论坛”陈凯东 Copyright 2012 JGC all rights reserved 2 目 录 日挥的介绍 生物制剂工厂的设计 技术要点 设备构建 最新动向 3. 业绩介绍（录像） Copyright 2012 JGC all rights reserved 日挥公司介绍 3 JGC World Operations Center 横滨 Laboratory (Oarai, Ibaraki Pref.) Copyright 2012 JGC all ri
2、ghts reserved 4 1928年 10月成立， 1969年东京股票第一部市场上市 注册资金 营业额 (2011年 财度 ) 雇员 日挥营业据点 子公司 235亿日元 (约合 17.7亿人民币 ) 5569亿日元 日挥集团 9,200人 (其中日本国内 4,500 + 海外 4,700 ) 日本国内 2处 海外 10处 日本国内 28 海外 22 横滨总部 日挥公司介绍 Copyright 2012 JGC all rights reserved 5 日挥公司介绍 制药工厂建设业绩 （例） : API Oral Solid Dosage Parenteral Packaging and
3、 Warehouse Bio pharmaceuticals Tissue Engineering Copyright 2012 JGC all rights reserved 日挥在生物技术领域的业绩 6 Food Environmental 设计和建设 1000m3 的石 油 蛋白发酵生产工厂 （ 罗马尼亚 ） 日 挥 由 CVI公司 引进 150L生物反应器 设计和建设应用微载体细胞培养技术的培养设备 Fine Chemical 生物药品 Energy 再生 医疗 利用固定化酵母的乙醇发酵设备 开设神户先端医疗中心 /设计和建设再生医疗设施 公布重组 DNA技术工业化指南（旧称通产省）
4、日挥参与了指南的制定 通过微生物培养 生产药品 通过动物细胞培养 生产药品 抗体药品 受托生产设备 设计和建设抗体药品受托生产 工厂 设计和建设微生物培养多品种工厂（ Launch Plant ） 设计和建设对应 再生医 GMP的设施 设计和建设微生物培养受托生产工厂 设计和建设应用浮游细胞培养技术的培养设备 Copyright 2012 JGC all rights reserved 7 抗体药 物生产工艺概略 细胞培养 细胞去除 Protein A层析 Capturing 病毒灭活 去除 阳离子交换层析 Purification 阴离子交换层析 Polishing 最终过滤 Copyrig
5、ht 2012 JGC all rights reserved 8 抗体药物生产技术要点 提高抗体的产生率 基因重组载体系统 使用的宿主细胞株 使用的培养基 培养方法 细胞培养罐 提高抗体药品的质量 分离纯化工艺的研发 一次性技术（ Disposable Technology） 制药用水规格 生产环境 （ 包含生物危害（ Bio-hazard） ） 生产 研发 Copyright 2012 JGC all rights reserved 9 DHFR (DeHydroFolate Reductase 二氢叶酸还原酶 ) 表达系统 常规方法 在 DHFR抑制剂 （ MTX)的存在下进行选择，可获
6、得高表达的重组体 。 GS（ Glutamine Sythetase 谷氨酰胺合成酶 )表达系统 Lonza Biologics技术 GS的催化反应 ： 谷氨酸 氨 谷氨酰胺 在不含谷氨酰胺而含有谷氨酸的培养基中，且在 GS抑制剂 （ MSX） 的 存在下进行选择，可获得高表达的重组体。 （ 将 CHO cell作为 宿主 的情况下 ） 利用了能妨碍培养进行的氨，并且能抑制培养液中氨的水平 。 （ 特别有利于分批培养 /流加培养（ Batch/Fed Batch培养） ） 通过使用含有谷氨酸的培养基，葡萄糖的消耗速度被抑制，由此可抑制妨碍培养进行的乳酸的蓄积 。 抗体药物生产技术的要点 （ 提
7、高抗体的产生率 ） 基因重组载体系统 Copyright 2012 JGC all rights reserved 10 CHO:Chinese Hamster Ovary Cell中国仓鼠卵细胞 CHO-K1 CHO-DG44;CHO-DUKX-B11： DHFR表达系统 CHO-K1SV(Lonza);CHO-S (Invitrogen): 浮游驯化 ;GS表达系统 PER.C6: Human embryonic retinoblast cell (transformed with Adenovirus type 5 E1A and E1B sequences) PERCIVIA公司 （
8、DSM Biologics和 Crucell N.V.的合资公司 ） 的技术 来自人类视网膜的细胞株 达到 3.5g/L以上 抗体蓄积浓度 抗体药物生产技术的要点 （ 提高抗体的产生率 ） 使用的宿主细胞株 提高细胞的抗体生产能力、 并加快生产速度，增加 抗体 蓄积浓度 。 0.1 1g/L 10 /L CHO-K1 细胞 PER.C6 细胞 Copyright 2012 JGC all rights reserved 11 从含血清培养基向无血清培养基转变 无血清培养基的优点 防止 BSE,病毒的混入 降低纯化工艺的负荷 提高产生率 无血清培养基的缺点 不能利用血清所具备的效果 。 (使 p
9、H值保持稳定 ,保护细胞免受剪切力的损害 ） 可能不能够实现稳定的培养 抗体药物生产技术的要点 （ 提高抗体的产生率 ） 使用的培养基 必须研发产生率高的无血清培养基 Copyright 2012 JGC all rights reserved 12 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 培养方法 培养 方法 分批培养法 （ Batch Culture） 流加培养法 （ Fed-batch Culture） 重复分批培养法 （ Repeated-batch Culture） 灌注培養 法 （ Perfusion Culture） Copyright 2012 JGC all righ
10、ts reserved 13 Initial medium charge provides all nutrition for entire run. MSeed Culture Harvest 5 10 ViableCellDensity(cells/ml) Culture Time (Days) 106 105 104 0 Product conc.Fermentor 分批培养 法（ Batch Culture) 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 培养方法 Copyright 2012 JGC all rights reserved 14 Concentrated nutri
11、ents/factors are added during the run. MMSeed Culture Harvest Conc.nutrient/ factors 5 10 ViableCellDensity(cells/ml) Culture Time (Days) 106 105 104 0 Product conc.Conc.nutrient/ factors Fermentor 流加培养法 （ Fed - Batch Culture) 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 培养方法 Copyright 2012 JGC all rights reserved 15 A
12、fraction of the biomass provides seed for next cycle. MSeed Culture (initial) Harvest 9/10 Vol. Medium 9/10 Vol. M5 10 106 105 104 0 ViableCellDensity(cells/ml) Culture Time (Days) Product conc.1/10 Biomass remained Fermentor 重复分批培养法 （ Repeated-batch Culture） 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 培养方法 Copyright 2
13、012 JGC all rights reserved 16 Media are continuously exchanged (e.g., by gravity or centrifugation or filtration) MMFermentor Continuous feeding Harvest (without biomass) Cell Return Separation system 5 10 ViableCellDensity(cells/ml) Culture Time (Days) 108 107 106 0 Perfusion start Product conc.Co
14、ntinuous Culture 灌注培养法 （ Perfusion Culture） 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 培养方法 Copyright 2012 JGC all rights reserved 17 动物细胞培养方法 分批培养法 （ Batch Culture） 流加培养法 （ Fed-batch Culture） 重复分批培养法 （ Repeated-batch Culture） 灌注培养法 （ Perfusion Culture） 抗体产生率最高 /培养不稳定 ： 灌注培养法 培养稳定 /抗体产生率 最小 ： 分批培养法 重复分批培养法 /流加培养法 在主流
15、Copyright 2012 JGC all rights reserved 18 动物细胞大量培养装置 （日 挥 大洗研究所） 抗体药品生产技术要点 （ 提高抗体的产率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC all rights reserved 19 无菌化及无菌保持技术 氧气供给方法 培养条件控制技术 搅拌技术 细胞大量培养技术 主要构成技术 抗体药品生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC all rights reserved 20 要点 争论点 高度无菌管理为绝对条件 灭菌后无菌性的保持 本公司的技术 方法 用蒸汽进行
16、灭菌是基础 ： 121 15分以上 所有蒸汽通过的机器和管道的设计及其布局（ Layout） 冷点，零死角设计 阀门的构造和构成 灭菌后保持正压 对灭菌温度的验证（ Validation） 无菌化及其保持技术 基于长期动物细胞培养的业绩 抗体药品生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC all rights reserved 21 要点 争论点 搅拌可产生剪切力 造成细胞损伤 通气方法为从上面进行通气，利用简单的 Sparger， Silicone Tube等 本公司的技术 方法 利用特殊的喷雾器（ Sparger）从底部通气 可实现极少量的氧气
17、供给 氧气供给方法 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC all rights reserved 22 要点 争论点 控制条件使之不偏离设定值 Hunting导致细胞损伤 以往只用 PID来控制是不够的 特别是高精度温控是很重要的 控制精度 ： 无法将温度控制在 37 0.1 0.2 。 有必要防止温度过冲（ Overshoot）超过 37 。 本公司的技术 方法 通过试错（ Trial and Error）积累的相关数据经验实现模糊控制 通过 模型预测控制（ Model Predictive Control） 实现高精度温调 两种控
18、制方式均可以实现精度非常高的温度控制 实现 37 0.1 0.2 防止温度过冲 培养条件的控制技术 抗体药品生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC all rights reserved 23 要点 争论点 应维持细胞呼吸、代谢所必需的搅拌状态 氧气和二氧化碳的传质 搅拌可同时抑制剪应力、维持传质速率 本公司的技术 方法 在搅拌罐的设计上具有丰富的业绩 通过实证、功能分析探讨搅拌操作条件的妥善性 探讨大规模生产（ Scale up） 搅拌技术 抗体药品生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC al
19、l rights reserved 24 O2气泡 及 O2浓度 剪应力 CO2浓度 Low High 搅拌技术 CFD模拟 事例 抗体药品生产技术要点 （ 提高抗体的产率 ） 细胞培养罐 Copyright 2012 JGC all rights reserved 25 培养 液（ 培养 Broth) 使培养中的细胞破坏最小化 细胞去除单元操作 （ 抗体蛋白存在于细胞外 （ 培养液中 ） 过滤 离心分离 利用色谱分离实现阶段性的纯化工艺 Protein A (对抗体蛋白特异性识别并结合的蛋白质 ） 阳离子交换 阴离子交换 原料药液浓缩用 UF膜 纯化工艺中的病毒清除 抗体药物生产技术要点 （
20、 提高抗体药物的质量 ） 分离纯化工艺的研发 分离可使细胞破坏最小化 很好地解决了缓冲液的差异问题， 以最小工数实现高效率精制 Copyright 2012 JGC all rights reserved 26 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体药物的质量 ） 一次性技术（ Disposable Technology） 优势 成本 （ 减少固定资产 ） 不需要 C/SIP以及清洗验证 削减了 C/SIP所必要的公用设施 (WFI， PS)的使用 高效的空间利用 一次性使用可防止交叉污染 保护操作者 可灵活地变更工艺 劣势 完整性 密闭 性 与药剂等的适应性 （ 来自于 film材料的化学物质的
21、溶出 ） 废弃物处理 （ 固体废弃物 ） 操作上的熟练度 （ 袋子的安装设置等 ） 温度控制 出 处 ： ISPE Baseline Guide Biopharmaceutical Manufacturing Facilities 欧美的生物制剂厂家不断地将其变成通用的技术 。 而日本仅停留在一部分技术的使用阶段 。 Copyright 2012 JGC all rights reserved 27 关于生物药品生产所使用的制药用水水质的观点 水 的用途 动物细胞 微生物细胞 培 养 纯化水 、 高度纯化水或 WFI1) 饮用水 5)、 工艺用水 3)或纯化水 采收 /回收 及粗精制 与上一工
22、程使用的为 同等质量的水 2) 与上一工程使用的为 同等质量的水 最终精制 纯化水或 WFI 4),5) 洗涤用水 (initial) 最终冲淋水 饮用水或高于其质量的水 生产工程所用的水 由 ISPE Baseline Guide Biopharmaceutical Manufacturing Facilities改変 1) 动物细胞的培养和微生物细胞相比，对水质的感受性较高。为了去除病毒有必要加热处理 2) 在由于工艺原因不能去除 生物负荷 （ bioburden） /热源 (pyrogen)的精制工程中，要使用最终水质 。 3) 工艺用水 ： 去离子水 、 除盐水 etc. 4) 在内毒
23、素为 0.25EU/ml下管制特定微生物的纯化水，实际上采用 WFI的情况很普遍 5) 根据不同地方规定所定义的饮用水，有必要对其进行管理以确保其质量符合工艺的要求 抗体药物生产技术要点 （ 提高抗体的产生率 ） 制药用水规格 Copyright 2012 JGC all rights reserved 28 生物危害对象范围及生物危害设计思想 （ 基于动物细胞培养的生物制剂的生产 ） 种子培养 预培养 培养 细胞 分离 灭活 前 精制 出 厂 制作 培养基 配制 缓冲液 批量 灌装 配制 缓冲液 BSL对象范围 (病毒可能存在的范围 ） GILSP对象范围 （ 转基因生物可能存在的范围 ）
24、培养废液处理 （ Cal tank） 灭活后 精制 关于转基因生物的生物危害设备的对应，从卡塔赫纳条约批准生效之后， 在重组动物细胞的情况下，已经变成了生物危害对象之外，对其要求事项也没有了。 另一方面，通过对动物细胞由来或其原材料由来的病原性病毒污染进行安全性评估， 从而设计安装基本上没有病原性病毒的具有检查原材料和产品的能力及具有灭活 去除 能力的生产工程，大体上极大地降低了病源性病毒所致的污染风险 。 因此，关于在生物学制剂等生产场所中的生物安全对应，根据 的观点，由于可以认为 基本上不存在病原性病毒，对于作为操作环境的建筑物和设备以及安全场所，到灭活前 精制步骤为止，可以实施 BSL-
25、2 的建筑物设备对应。完全实施 BSL-3对应被认为是 不必要的。 Copyright 2012 JGC all rights reserved 精制工程中的病毒灭活 用 Protein A洗脱液 （ pH3)保持 30分钟，使病毒灭活 精制工程中的病毒清除 安装除病毒过滤器 用以上方法计算出总病毒清除指数 （ Log Reduction Value; LRV) 通过实施小规模工艺中利用模型病毒的 spike test，实施病毒验证，以评估工艺中的除病毒能力 病毒清除 在生产工艺中 总病毒清除指数与病毒验证 Copyright 2012 JGC all rights reserved 利用细胞培养生产蛋白质 30 O2要求量小 剪 应 力 弱 通 气量 、 搅拌动力 小 变化量 小 环境变化对应力 弱 需要精密的 控制 控制范围 小 培养罐大小为 10 20m3 分批式培养 、 灌注式培养 易被 CO2氨等 抑制 去除抑制物质的 方法是必要的
