1、1实验四 用遗传标记鉴定水稻品种的亲缘关系一、目的1、了解袁隆平的杂交水稻三系配套和杂种优势利用的基本理论。2、遗传标记用于水稻三系及杂种 F1 间亲缘关系的初步鉴定的基本原理3、初步掌握 PCR 和琼脂糖凝胶电泳技术二、原理1、三系配套、杂种优势和遗传标记用于水稻品种亲缘关系鉴定的基本理论和原理植物在生长发育过程中，由于受环境条件影响或自身遗传突变导致雄性生殖系统退化不能产生花粉或者产生的花粉缺乏正常的功能，而雌性生殖系统发育正常的一种生物学现象，称为雄性不育。植物雄性不育在自然界普遍存在，据统计，已经在 43 个科、162 个属、320 个种的 617 个种和种间杂种中发现了雄性不育现象（
2、徐秉芳，2000 ） 。如果雄性不育遗传方式符合孟德尔遗传规律的，称核雄性不育（Genic male sterility，简称 GMS） ；如果以母性方式遗传，则称之为细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，简称 CMS）(Kaul, 1988)。袁隆平的最大贡献在于最早实现生产上大面积应用的杂交水稻三系配套。所谓的杂交水稻三系是指（细胞质）雄性不育系（A 表示） 、保持系（ B 表示）和恢复系（R 表示） ，不育系是以细胞质母性方式遗传的，不育基因现在基本确定是线粒体基因。不育系与强恢复系杂交后经人工选择可获得产量、品质和抗病性等均有明显超越亲本性状的杂种 F1
3、 代，可用于生产应用，这就是杂种优势利用。可是，不育系（A ）本身不育，一季后就无法大量保存（可以用稻兜保存） ，生产上也就无法大面积应用。保持系（B）与不育系杂交则能结种子，而且结的种子在长成植株后又是与原来的不育系完全是一样的，也就是保持系（B）能使不育系大量地繁殖以适合于生产应用。不育系（A）与保持系（B ）的区别基本上是不育系存在不育基因，而保持系不存在不育基因。恢复系（R ）与不育系（ A）基本上是毫不相关的品种，当然恢复系也是没有不育基因的。不育系的不育基因基本确定是线粒体（细胞质）基因，因而不育系（A）与恢复系（R）杂交后代 F1 应该含有不育基因，F1 长成植株后本身是可育的，
4、主要原因是恢复系提供的细胞核基因能恢复它的育性。生产上应用的是 F1 杂交种子，而生产 F1 杂交种子成本较高，因而商业经营上可能会有人以恢复系（恢复系本身往往是曾经或正在生产上应用的品种，自交收种子就行，成本低）代替。为了大致区分水稻细胞质雄性不育系（A） 、保持系（B） 、恢复系（R）和杂种F1 种子，我们可以根据已知的不育系（A）的不育基因设计引物，分别以 A、B、R 和 F1 全基因组 DNA 为模板，经过 PCR 和电泳检测，有目的 PCR 产物带的是不育系 A 和杂种 F1，无目的带的是保持系 B 和恢复系 R，这样就基本上可以将杂种 F1 与恢复系 R 初步区分出来。2、 PCR
5、 反应原理 2PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，它是近年发展起来的一种体外扩增特定目的 DNA 片段的技术。PCR 技术实际上是在模板 DNA、引物和种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分 3 步：变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA；退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机
6、会较少。延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP 底物及 Mg2+存在的条件下，53 的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应。以上 3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，2-3 小时之后，介于两个引物之间的特定目的 DNA 片段得到了大量复制，数量可达 21067 拷贝。3、琼脂糖凝胶电泳检测的基本原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全
7、部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。三、材料粤泰 A、粤泰 B、9311 （恢复系 R）和红莲优 6（杂种 F1）的全基因组 DNA。四、主要的器具、药品试剂主要仪器设备：PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉主要药品试剂：PCR 反应：1. 上下游引物: 浓度为各 10 pmol/l 。F: ATG GCA AAT CTG CTC CGA TGG CTCR: TT
8、A CTT AGG AAA GAC TAC ACGorfH79sequence: （不育基因序列）ATGACAAATCTGCTCCGATGGCTCTTCTCCACTACCCGAGGGACTAACGGTCTTCCATATTTCATCTTCGGTGTCGTTGTAGGAGGCGCCCTGTTGTTTGCTTTGCTAAAGTATCAGGCCCCTCTGTACGACCCGGCTTTATTGGACAAAATCATAGATCATAATATAAAAGCCGGGTACCCTATAGAGGTTGACTATTCGTGGTGGGGCACCTCTATTCGTGTAGTCTTTCCTAAGTAA 2DNA 模板浓度为
9、 100ng/ l。310buffer（购买 Taq 酶配套 buffer）：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-3Cl，pH9.0 ，1% Triton-X 1004MgCl2：25mmol/L。5dNTP 2.5mmol/L：分别取等体积 10mol/L 的 dATP，dGTP ，dTTP ，dCTP 混合即成6Taq DNA 聚合酶：浓度为 2.5 U/l 。7灭菌双蒸水电泳：1. 琼脂糖2. 6载样 buffer 0.25% 二甲苯青 FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油350TAE 电泳 Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.
10、25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至 50ml。4溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每 100ml 琼脂糖凝胶加 5l 贮存液，即凝胶中 EB 终浓度为 0.5g/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。5. DNA Marker：共 6 条带， 2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上样6ul 时 750bp 的带约为 100ng，其余带约为 50ng6各种国产移液器(10，20， 100l)7消毒的 tips 枪头8水平电泳槽和电泳仪五、实验操作（一）PCR：各种试剂置冰盒中，取已灭菌的 0.2ml PCR 管
11、，于冰上按下表操作：（ 20l 反应体系）试剂 加入量 终浓度(或含量)DNA 模板 2l 100ng10buffer 4l 1bufferdNTP 2l 2.5mmolMgCl2 1l 约 2.5mM/L上下游引物 2l（各 10 pmol/l） 各 10pmolTaq DNA 聚合酶 1l (2.5 U/l) 1.25U无菌 ddH2O 补足 20l总体积 20l 用枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，编号。于 PCR 仪上进行 PCR 反应。反应程序设置为：94 预变性 5min 4以下 35 次循环 94 变性 30S55 退火 30s72 延伸 60s循环后 72 5min（二） 、琼脂
12、糖凝胶电泳检测1、胶液的制备：称取 0.4g 琼脂糖,置于锥形瓶中,加入 50ml 1TAE 稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为 0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容
13、易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入 1TAE 缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4、加样：取 1l PCR 产物 DNA 溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。 PCR 产物加样完毕，选取一个未加样点样孔加入 6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换 tip 枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在 5V/cm。当溴酚蓝条带移动
14、到距凝胶前沿约 21cm 时,停止电泳。 6、染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 0.5g/ml 的 EB 溶液中,室温下染色 20-25分钟。 7 、观察：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板 。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。注意 EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套 ,并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。六、结果与分析（作业）由琼脂糖凝胶电泳结果分析 PCR 结果如何？请把电泳图贴上，初步分出两组：一组是不育系粤泰 A 和杂种 F1 红莲优 6，另一组是保持系粤泰 B 和恢复系（R）9311 。
