1、四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力一、实验目的掌握 MTT 法检测细胞活力的方法。二、实验原理四甲基偶氮唑盐(MTT)为淡黄色粉末，水溶性好，易通过细胞膜而进入细胞。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶于水的紫色结晶物甲躜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。一般情况下结晶物的生成量与活细胞数成正比。酸性异丙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)或二甲亚砜(DMSO) 均能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲躜量成正比。用酶标仪在 5 7 0nm 波长处测定其吸光度 OD 值(A570nm) ，可间接反映活细胞数。MTT 法简单快速、准确，广泛用于新药筛选、细胞毒性试
2、验及肿瘤放射敏感性等实验中。它与前述细胞计数法等方法相关性良好，也可用 MTT 法测定细胞生长曲线。三、实验器材仪器 二氧化碳培养箱、酶标仪、9 6 孔细胞培养板、可调微量移液器、微孔板振荡器等。试剂 MTT 溶液：MTT 溶于 pH7.4 的 0。0 1molL PBS 液中，磁场搅拌 3 0 分钟，过滤除菌，配制成 2m9ml 的 MTT 液，4 冰箱贮存。二甲亚砜(DMSO)分析纯。细胞培养基。材料 对数生长期的 KB 细胞或其他贴壁培养传代细胞。四、实验步骤接种细胞 取对数生长期细胞， 0.2 5胰酶消化，加含血清培养基终止消化并吹打成单细胞悬液(悬浮细胞则不需消化 )，台盼蓝染色计数
3、(取 5 0l 细胞悬液，加等量的 0.4台盼蓝染液，正置或倒置显微镜下用血细胞计数板计数活细胞，不着色者为活细胞)后稀释,以 6000-40000 个细胞孔接种于 96 孔培养板( 应根据细胞体积及生长速度确定接种浓度，使实验结束时吸光度与活细胞数呈线性关系，吸光度在 02,-15 之间)，每孔接种体积为l001，另外设空白对照孔，只加完全培养基。在 37、含 5CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养一段时间(根据实验目的决定培养时间长短。如果是药物处理需要在培养 24 小时后换成含不同度实验药物的培养液和对照药或培养基对照，每孔 l001，每组设 4 个复孔，继续培养 48h)。然后加入 MT
4、T 液 201 每孔，继续培养 4 小时。吸出孔内培养液后，加入取出培养板，小心吸尽板中的培养液，各孔加 l50V1 DMS0 溶液，将平板置于微孔板振荡器上振荡 10min，使结晶物甲躜充分溶解。用酶标仪 5 70nm 处测定各孔的 0D 值，各孔均需减去空白对照孔的 0D 值。记录结果，按照下式计算细胞存活率：细胞存活率抑制率 五、注意事项1、接种细胞时为避免“四周效应 ”弃用外周孔。2、如培养的是悬浮细胞，每次吸弃上清液前最好离心培养板，如无离心板的离心机，每次吸弃上清液时要格外小心，尽量不要吸弃细胞，否则结果不准确。3、 MS0 溶解甲臌后由于稳定性差，必须及时测吸光度，放置数小时后再
5、测结果不准确。4、异丙醇溶解甲躜的能力有限，并且容易与培养液中的血清反应，产生絮状沉淀而干扰测定。DMS0 溶解甲躜的能力最强， l0 分钟内可将甲躜颗粒完全溶解，但需弃去上清，而日 DMS0 与残存的 MTT 发生反应，随着时间的延长而颜色加深，使测定本底 OD 值偏高，故比色必须在一定时间内完成。采用 10SDS 为溶解液，可部分克服上述缺点，但是溶解力有限六、实验结果与处理分析：5-Fu 尿嘧啶对人体胚胎肾细胞的抑制随浓度的增高而升高药物浓度在 40-200mol/ml 对细胞抑制变化不是很明显，可能是由于加 DMSO 时出错引起酶标仪读数错误。七、心得体会通过本次关于四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力测定的实验，了解并掌握了四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力的方法及其原理。观察了紫色结晶的生成以及其颜色的不同。在实验操作过程中，我组同学均认真且严格按照规定操作进行试验，每位同学都认真参与到了试验过程中，并且相互提醒相互帮助，谨慎有序的完成了本次实验操作。在实验过程中，能明显的看出蓝紫色结晶的生成，但是其梯度变化不够明显，相应的吸光度的测定值变化也不够明显。但总体实验步骤及变化均符合实验原理及结果。
