1、从组织器官分离细胞一、非酶分离细胞方法(一) 机械分离法 适用于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织、肿瘤组织等。1.组织研磨法：操作方法：(1)取消毒的碟皿( 直径 58cm 或略大) ，放入少许 Hanks 液或PBS;(2)将采取的小块组织先用 PBS 漂洗去组织表面的血污，剪成撕去附带的其它组织，如脂肪或多余的纤维、包膜等，切成 5mm3 左右大小的小块，放入碟皿内 Hanks 液或 PBS 中;(3)用锋利手术刀或眼科剪将组织剪切成 1mm3 左右的碎组织块;(4)将碎组织及 Hanks 液或 PBS 置于较松的组织研磨匀浆器内，用手缓慢研磨(可反复几次)，形成散在细胞
2、的匀浆。(5)将组织匀浆经 40 目或 100 目不锈钢网过滤去除纤维组织、血管及较大的凝块。过滤时可用 Hanks 液或 PBS 冲洗;(6)将过滤的细胞匀浆悬液直立静置片刻使较大的组织块及红细胞先沉淀，取上部细胞悬液，以 Hanks 液或 PBS 洗涤，离心，收集细胞;(7)计算活细胞率，计数细胞，制备成所需浓度的细胞悬液。注意：组织研磨匀浆器不能太紧，研磨时应缓慢，否则易使细胞损伤、破碎、或增高死亡细胞率。2.不锈钢网挤压法：操作方法：(1)将切取的组织块以 PBS 漂洗去表面血污，切成 510mm3 的组织块;(2)在消毒碟皿内放少许 Hanks 液或 PBS，把 40 目100 目的
3、不锈钢网放入 Hanks 液或 PBS 中，将组织块置网上，用消毒注射器芯或试管的底端轻轻压挤组织，使其穿过网眼入 Hanks 液或 PBS 中。同时，用 Hanks 液或 PBS 冲洗网上的组织。最后，将网上剩余的纤维包膜或血管等弃去;(3)收集 Hanks 液或 PBS 液中的细胞悬液显微镜检查，如仍有较多的小组织块，可用更细的不锈钢网(20m)重复压挤 1 次;(4)收集 Hanks 液或 PBS 细胞悬液。1000r/min 离心片刻使残留较大组织碎块及红细胞沉淀，吸取未沉淀的细胞悬液。再以 Hanks液或 PBS 洗涤，离心，收集 1 次;(5)计数活细胞率及计算细胞数，制备所需浓度
4、的细胞悬液。注意：如经 1 次压挤尚有较多的碎组织块，也可用消毒注射器，带 6 号注射针头，将细胞及碎组织从注射器内经针头压出，使细胞再次分散。3.吹打分离法：此法只适用于很松软的组织，如从脑组织分离胶质细胞。操作方法：(1)取小块脑组织，剥离脑膜，血管等纤维组织后，用 Hanks 液漂洗 2 次;(2)在消毒碟皿中放约 23 倍于脑组织的 Hanks 液，将脑组织置 Hanks 液中，用滴管吸取 Hanks 液反复吹打脑组织使成悬液;(3)将组织悬液经 40 目尼龙网过滤后，移入试管中直立静放510 分钟，较大的组织碎块及红细胞下沉，脂肪及碎细胞片等漂浮在液体上部。吸取中间部分的细胞悬液，并
5、如此反复 23 次;(4)取少许细胞悬液显微镜检查，如已制成较多的散在细胞悬液，可计数活细胞率。计数细胞用 Hanks 液或适当的培养液制备成所需浓度的细胞悬液。(二)EDTA 分离法 EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)，是一种螯合剂(chelatingagent)，能与组织内的 Ca2+、Mg2+ 离子螯合而使细胞分离。EDTA 常用 PBS 等配成 0.02%的工作液。其作用温和，在一般情况下对细胞损伤较小，但分离效果并不很高。可用于分离一些胚胎组织或肝脏灌流，不过较少单独使用，常和其它一些酶(如 0.25%胰蛋白酶)混合使用( 以 11 或 21 混
6、合);但不要与胶原酶混合使用，因这种酶依赖 Ca2+和 Mg2+，与 EDTA 混合后可使胶原酶的消化作用严重障碍或失效。与胰蛋白酶混合可用于分离培养细胞进行传代培养。其方法是将培养细胞的培养液吸去后，加入 0.02%EDTA 与0.25%胰蛋白酶的混合液，以盖满细胞为度，处理 310 分钟，注意不能消化过度使细胞收缩脱落。吸出消化液，立即用 Hanks 液洗涤23 次以洗去 EDTA。最后加入培养液，用滴管吹打使细胞脱落形成细胞悬液。使用 EDTA 应注意分离时间不能过长。因其对细胞的线粒体可有损伤，而且细胞长时间处于无 Ca2+环境下 (被 EDTA 螯合)则可使细胞内 K+降低; 同时呼
7、吸减弱也可造成细胞损害。(三) 其他非酶分离细胞方法 甘氨酸(glycine)也可用于分离细胞，如用含 1mol/L 甘氨酸与 2mol/LEDTA 的混合液分离海胆胚胎。双糖(disaccharides)，如高张蔗糖、乳糖、麦芽糖等 (常用 0.5mol/L)可分离细胞间的缝隙连接或紧密连接等。0.5%KOH 的稀碱溶液(pH9.3 左右)也可用于胚胎组织的分离。但如将 pH 恢复正常，则分散的细胞又可再聚合。二、酶分离细胞技术可用于分离细胞的酶很多。蛋白水解酶类有胰蛋白酶(trypsin)、胶原酶(collagenases)、弹性蛋白酶(elastase)、链霉蛋白酶(pronase)、溶
8、菌酶(lysozyme) 、木瓜蛋白酶(papain)等。其它酶类有透明质酸酶(hyaluronidase)，脱氧核糖核酸酶 (deoxyribonuclease)等。这些酶各有优缺点，对细胞的损伤也各不相同，所以对使用何种酶应按实验要求加以选择。比较常用的有胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶等。胰蛋白酶适于消化间质较少的组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等;对纤维性组织的消化能力较差。Ca2+、Mg2+对其活性有抑制作用，故配制时应不含 Ca2+或 Mg2+，或与 EDTA 配伍使用。胰蛋白酶的工作浓度为 0.01%0.5%，常配成 0.25%的工作液。室温及 37下消化比较恰当，4
9、时仍有缓慢的消化作用。最适工作pH 为 89 左右。消化时间最短(如胚胎组织)为 2030 分钟，一般为 3060 分钟，低温或低浓度时也可延长至 1218 小时(过夜) 。胶原酶适用于消化分离纤维组织，对上皮、肝、胰、肾及一些癌组织的细胞分离也比较适用。它有很多类型，Sigma 厂的产品有1、等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞或一般纤维组织，应按实验要求，按产品说明书选用。胶原酶与胰蛋白酶不同，它必须在 Ca2+及 Mg2+存在的条件下，才能较好地活化。常用的浓度为 100200U/ml( 按说明书配制。一般产品125U/mg，故工作浓度常用 0.05%0.1%，高纯度胶原酶可为12
10、00U/mg 或 10003000U/mg) 。该酶的作用缓慢，常需较长的消化时间。链霉蛋白酶为非特异性具有广谱性质的中性蛋白酶，适于分离消化道的粘膜上皮细胞及肝脏的 Kupffer 细胞。其消化速度比胰蛋白酶快。分离的消化道上皮存活率可高达 96%左右，较其它酶优越。透明质酸酶对间质中含多量透明质酸的组织比较适用，对热稳定，工作 pH 较宽，常可与其它酶配合使用以增加消化分离细胞的效果。(一) 胰蛋白酶消化分离细胞方法操作方法：1.在消毒碟皿中将组织剪切成 35mm3 左右的碎组织块;2.在小烧杯内放入 3050 倍的 0.25%胰蛋白酶，加入剪切碎的组织，在 37水浴或温箱中消化 3060
11、 分钟，每隔 5 分钟左右摇荡 1 次(用电磁搅拌器拌搅亦可);3.将消化的组织离心 1000r/min10 分钟，吸去上清液，以 Hanks液漂洗 23 分钟，再离心，去上清，重复 3 次以尽量洗去胰蛋白酶;4.用 100m 尼龙网或不锈钢网过滤，去除未消化分离的碎组织块、纤维等;5.再以 Hanks 液漂洗，收集细胞悬液;6.计数活细胞百分率，计数细胞数，用含 4%小牛血清的 PBS或 Hanks 液制备所需浓度的细胞悬液(加小牛血清不仅可以作为稳定剂，抑制分散的细胞凝聚;也可作为酶抑制剂，抑制与细胞表面结合的胰蛋白酶的消化作用)。(二) 胶原酶消化分离细胞方法操作方法：1.将切取的组织先用 Hanks 液或 PBS 洗净粘附的血污。在碟皿内剪切成 35mm3 碎组织块 ;2.在小培养瓶内加 45ml 培养液，放入数小块组织碎块，加入等量 0.1%的胶原酶( 终浓度约为 100U/ml 或 0.05%)，pH6.5;3.37温箱内消化 448 小时(不需摇荡) 。如消化缓慢，最长可延长至 45 天;4.待组织碎块软散于瓶底，振荡培养瓶便成细胞悬液;5.将细胞悬液离心 1000r/min1015 分钟，去上清，以 Hanks 液漂洗，离心，去上清，并重复洗 23 次。6.计数活细胞及细胞数，用含 5%牛血清的新培养液制备所需浓度的细胞悬液。
