1、基因工程概论,多利和它的孩子,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,吴明杰小组：5只克 隆猪,第一章 绪 论,基 因（gene）,基因研究发展的过程,基因的现代概念,基因的特点,基因工程（genetic engineering）,基因工程研究发展史,基因工程研究的主要内容或步骤,基因工程的应用,基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。它的创立和发展，直接依赖于基因工程或称分子生物学的进步，两者之间有着密不可分的联系。基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；而基因工程技术的发展和应用，又深刻并
2、有力地影响着基因的研究，使我们对基因的研究提到了空前的高度。因此，对基因研究发展的过程，以及基因的现代概念进行一下回顾是十分必要的。,基因工程与基因,基 因（gene） 一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。,基因研究发展的过程,A brief history of genetics.,1866年，孟德尔（G.J.Mendel）提出了遗传因子（hereditary factor）的概念。他将控制豌豆性状的遗传因素称之为遗传因子形成了基因的雏形。,豌豆杂交操作,孟德尔研究的七对性状,孟德尔分离律,孟德尔自由组合律,黄圆 绿圆 黄皱 绿皱,1909年，丹麦的遗传学家W. Johansse
3、n根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一词。但它只是一个抽象的单位，并不代表物质实体。,“遗传因子/基因”的设想一经提出，便推动人们去寻找，去探索 基因在哪里？ 基因是什么？,显微镜技术与染色技术的发展，使人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的等位基因的分离规律相当一致，所以，确定基因在细胞核中，在染色体上。,同源染色体分别带着控制,同一性状的两个等位基因,显性等位基因 纯合子,隐性等位基因 纯合子,杂合子,1910年，美国遗传学家摩尔根（T.H.M.organ）以果蝇为研究材料，发现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说，第一次将代表某一特定性状的基因与某一
4、特定的染色体联系起来，即基因位于染色体上。,野生果蝇没有现成的成对性状 摩根在长期饲养中找到各个性状的突变株。,控制不同性状的等位基因,在2#染色体上的位置,触须 长/短,身体 灰/黑,眼睛 红/紫,翅 长/短,1944年，美国微生物学家O.T.Avery首次证实遗传物质的基础是DNA，基因位于DNA上。,The transforming principle is DNA.,DNA is the genetic material,分别用放射性同位素标记噬菌体,35S 标记蛋白质,32P 标记 DNA,35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞,32P 标记 DNA ,感染后放射标
5、记进入大肠杆菌细胞,1953年，J.Watson和F.Crike创立DNA双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的DNA片段。,A B Z,DNA 双螺旋模型说明 DNA 分子能够充当遗传的物质基础。 按照双螺旋模型，在细胞分裂时，DNA 的合成应是“半保留复制”的模式。,半保留复制,1955年，Benzer在T4噬菌体的顺反互补实验中，正式使用 “顺反子（cristron）”这个术语，并将顺反子与基因在意义上和功能上统一起来。 同时证实了基因不是最小单位。它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，只有其中某一特定的核苷酸区段才是基因的编码区。,1960年，F.Jacob和J.Monmd提
6、出了操纵元（操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达调控的重要规律。,基因的现代概念移动基因（movable gene）断裂基因（split gene）假基因（pseudogene）重复基因（repeated genes）重叠基因（overlapping genes） 或嵌套基因（nested genes）,移动基因（movable gene）,又称为转位因子（transposable elements），由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，因此又叫做跳跃基因（jumping genes），最早在玉米中发现。它又分为插入序列、转位子、逆转座子。,断裂
7、基因（split gene） 是指编码序列不连续的间断基因，最初在腺病毒(adenovirus)中发现。,应用S1核酸酶作图法测定断裂基因中的间隔子,假基因：类似于基因但不表达的DNA序列。 不表现任何功能，是基因的退化形式。假基因在基因组中形成稳定的和无活性的拷贝，由活化的原始基因突变而来，这是因为存在着在某个阶段伤及基因表达的一种或多种缺陷（入启动子错误、有缺陷的剪接信号、框架中有终止信号等）之故。一旦不能产生正常的基因产物，就失去了对发生进一步突变的选择性屏障作用，因此典型的假基因都有很多缺陷。某些假基因有3-多聚A尾巴及准确地切掉了内含子，因而与mRNA类似，被认为是源自插入基因组的逆
8、转录体（可能由某些病毒携带）。,假基因又分为两种：重复的假基因（repeated pseudogene ）： 许多假基因都是同亲本基因（parental gene）连锁的，而且同其编码区及侧翼序列的DNA具有很高的同源性。 加工的假基因（processed pseudogene） 这类假基因没有与“亲本基因”连锁，而且其结构是同转录本而非“亲本基因”类似。 加工的假基因与转录本都没有启动子和内含子，3端都有poly（A）尾巴。,人的及 珠蛋白基因簇， 表示假基因,重复基因（repeated genes）,不重复的唯一序列（只有一个拷贝）包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列低度重复序列
9、（10个拷贝）,中度重复序列（10到几百个拷贝）特点：重复单位序列相似，但不完全一样散在分布于基因组中序列的长度和拷贝数非常不均一中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记分类：中度重复序列可能是转座元件(返座子) 长散在重复序列(longinterspersedrepeatedsegments) LINEs：长度1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105 ，如人LINEl短散在重复序列(Shortinterspersedrepeatedsegments) SINES：长度105.如人Alu序列,高度重复序列（几百个拷贝到几百万个拷贝） 卫星DNA(SatelliteDNA),重叠
10、基因（overlapping genes）或嵌套基因（nested genes）,类型：一个基因的核苷酸序列完全包含在另一个核苷酸序列中。由于它们的读码结构互不相同，因此编码着不同的蛋白质。2个基因的核苷酸序列之末端密码子相互重叠。,基因的特点 :不同基因具有相同的物质基础 在原则上，所有生物的DNA都是可以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，他们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物的DNA结构都是一样的。 有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒RNA可以通过反转录产生CDNA，并不影响不同基因的重组互换。,基因是可以切割的 基因在染色体上的存
11、在形式是直线排列。大多数基因彼此之间存在这间隔，少数基因是重叠排列的。,基因是可以转移的 生物体内有的基因是可以在染色体上移动的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。基因在转移的过程中就完成了基因间的重组。（转座子、反转座子）,多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。,遗传密码是通用的 一系列的三联密码子（除极少数外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。,基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。,目前世界许多国家将生
12、物技术，信息技术和新材料技术作为三大重中之重技术，而生物技术可以分为传统生物技术，工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。,基因工程（genetic engineering） 也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。,基因工程研究发展史,基因工程的准备阶段 理论基础 在40年代
13、确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。在50年代揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。 在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了信息的流向和表达问题。,中 心 法 则,由于基因工程是一门内容广泛、综合性的生物技术学科，在60年代科学发展的水平下真正实施基因工程，还存在许多问题，特别是在技术方面。生物有机体，尤其是具有复杂结构的真核生物，其DNA含量是十分庞大的。,DNA content of the haploid genome is rela
14、ted to the morphological complexity of lower eukaryotes, but varies extensively among the higher eukaryotes. The range of DNA values within a phylum is indicated by the shaded area.,每个基因都被认为是编码着一种蛋白质分子，所以人们一直十分重视研究单基因的结构与功能的关系。怎样分离单基因，以便能在体外研究其结构和功能的一系列问题，成为基因工程的关键所在。,技术基础 20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连
15、接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。 70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。 这两项技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决。 1972年首次构建了一个重组DNA分子，并提出了体外重组的DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。 在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。,基因工程的问世 1973年Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时与S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，
16、转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式问世；并说明了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到原核生物细胞中并在其中实现功能表达。,基因工程的迅速发展阶段 自基因工程问世以的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。如果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，那么二十一世纪初将是基因工程应用研究的鼎盛时期。,基因工程研究的主要内容或步骤,从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；
17、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； 从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,基因工程研究的基本技术路线,基因工程流程示意图,基因工程的应用 基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。,在医学上的应用 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。,胰岛素,1000 磅牛胰 10 克胰岛素,200 升发酵液 1
18、0 克胰岛素,干扰素,1200 升人血 1 升发酵液,23 万美元 / 病人 200300 美元 / 病人,用于提高奶酪产量 生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝乳酶，大量用于奶酪制造。,哺乳小牛 凝乳酶基因,胃 转入啤酒酵母,凝乳酶 凝乳酶,制造奶酪,转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,转基因植物获得新的性状,工程菌在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,喷洒工程菌清除石油污染,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,噢噢！,GAME IS OVER.,Versatile cloning plasmid,Phagemid(噬菌粒）,
