1、神经细胞培养,第一节：细胞培养的基本知识,1定义：细胞培养 (cell culture)： 组织培养 (Tissue culture) ：器官培养 ( organ culture)： 统称为体外培养 （In vitro),2 组织或细胞培养的优点：,1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制3）：研究的样本可以达到比较均一性4）：研究的内容便于观察、检测和记录5）：研究的范围比较广泛6）：研究的费用相对比较经济,3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性,4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型
2、细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性细胞的生长过程：原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代之前称为原代细胞或原代培养传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代细胞系的生长过程：有限细胞系：原代培养传代期衰退期无限细胞系：滞留期指数增长期平台期,有限细胞系,无限细胞系,指数细胞数量,培养时间（周）,原代培养,细胞系阶段, 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 促生长因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类为3
3、537；鸟类为38.5 b 气相及PH 值 ：O2及CO2的值： CO2=5%；空气=95%；PH=7.27.4 c 渗透压：260320m mol/L,3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！ 无毒：与细胞直接接触者培养器皿、底物、培养基等；间接接触者配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染,常用的培养用液及培养基,培养用液：水平衡盐溶液（）消化液胰蛋白酶液（%）二乙烯四乙酸二钠（）胶原酶培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）合成培养基（）等）,常用的平衡盐溶液（g/L）,第 二节：神经细胞的培养技术,神经元的原代培养神经胶质细胞的
4、培养神经干细胞的培养,一 神经元的原代培养(Primary culture)常用试剂1）DMEM 培养液：加10%热灭活胎牛血清，30m mol/L 葡萄糖，293.2mg/L L-谷氨酰氨，24.5m mol/L KCl，100mU /L 胰岛素，青、链酶素各10万，HEPES 2.8383gPH 值7.2，过滤除菌，-20 保存。2） D-Hank液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS）,聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min3）细胞准备(大鼠神经细胞培养）： 新生13d SD大鼠，75%酒精浸泡约5min，移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D
5、-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织，放入10ml小瓶中剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37培养箱，定期振摇促消化。消化约20min，用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min，吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，,用含20%血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1106/ml细胞悬液，接种于经聚赖氨酸处理过的24孔培养板（板孔放置0.80.8cm的小盖玻片）或培养瓶内，放入5%CO2培养箱，37培养。）神经元的纯化：培养两至四天后用含510 mol/L
6、胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养24 hour ,然后改用常规培养液。）神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） 神经元,神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显的光晕。接种一般在6小时可贴壁；8小时已有纤细有突起长出24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为主培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些具有分枝的突起，培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的
7、胞体，发育良好的突起。,MAP-2,A,B,NSE stain neuron,TH stain neuron,Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus,Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50m),N,运动神经元 Dil标记,Purkinje cell in culture (PEP-19),2 胶质细胞的培养胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞 星形胶质细胞 原浆性 少突胶质细胞 b小胶质细胞,胶质细胞的培养：特点：比较容易在体外培养
8、生长，生长稳定，可以传代培养。贴壁过程慢，初期生长慢。传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。,培养的方法： 1）取材 脑灰质或白质 2）洗涤 （Hanks液） 3） 移入试管吹打形成单细胞悬液 4） 静置10min 弃上层 5）过滤后收集细胞悬液，调整细胞密度104106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱培养 6）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可）,传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分 表面以前，不要急于传代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使细胞尽快适应新环境鉴
9、定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein GFAP） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（-galactosidase),GFAP,human Schwann cells,3 神经干细胞（NSE）的培养：,NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑
10、肿瘤等神经系统疾病寻求了一条新的途径神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞;成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层,神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的培养特点呈神经球形式生长发展史: Reynolds和 Weiss1在体外用表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）从脑组织中培养出神经球并发现其能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；将初次形成的神经球消化传代可形成二级神经球，它们同样具有多向分化潜能；说明EGF在体外可将NSCs维持在未分化状态并可促进其增加细胞数量。Johe 2和Gritti4则用碱性成纤维细胞生长因子（b
11、asic Fibroblast Growth Factor, bFGF）也同样从脑组织中获取到呈神经球形式生长的NSCs，也可以促进这种具有多向分化潜能的神经球在体外存活和增殖. Shimazaki的实验证明白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）可将来自哺乳动物前脑的NSCs在体外培养条件下维持在未分化状态增殖3 。,2.1 主要试剂及溶液的配制2.1.1 无血清培养基DMEM/F12培养基 1袋NaHCO3 3.7g溶于1升经高压灭菌消毒后的去离子水中， 0.22um滤膜过滤,分装，4保存。使用前，加入EGF(20ng/ml)和/或bFGF(20ng
12、/ml) 和/或LIF、N2和鸡胚浸出液（5%）。加50%血清和10%DMSO。细胞消化液： 配成0.5%的胰蛋白酶(用高压的PBS)并以0.22um滤膜过滤, 同时配成0.04%EDTA（用D-Hanks液）高压灭菌消毒, 将两种液体以等体积混合使其终浓度为0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA，分装，-20贮存。,取材：取3月龄Waster大鼠一只解剖显微镜下用显微手术镊剥除脑膜及血管，分别取出海马和室管膜下区组织，置于盛有冰冷D-Hanks液的平皿中。 用双面刀片将组织切成1mm3的块状 组织移入已预温至37含有0.25%胰蛋白酶 (Trypsin) 和0.02%EDTA的10ml离心管
13、中消化，离心5-10分钟，弃上清，用含高糖的DMEM/F12(1:1)重悬细胞, 用300目滤网过滤.按10%的比例加入血清，培养12-16小时或过夜。 更换成完全培养基（添加5%CEE、bFGF（终浓度为20ng/ml）、EGF（终浓度为20ng/ml）、胰岛素（25g/ml）、葡萄糖（0.6%）、HEPES（5mM）、Glutamine（2mM）和N2的DMEM/F12），接种后7-9天传代一次。,传代：将培养获得的神经球吸出，置于离心管中，用吸管轻轻吹打约20次左右，使细胞球成单细胞或小的细胞球。置于含LIF（终浓度2-4ng/ml）的完全培养基中继续培养。,1Reynold BA, W
14、eiss S . Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science , 1992 ,255:1707-1710. 2Johe KK, Hazel TG, MaKay RDG, et al . Single factors direct the differentiation of stem-like cells from foetal and adult nervous system. Genes Dev, 1996; 1
15、0: 3129-3140. 13Shimazaki T, shingo T, weiss S. The ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci, 2001; 21(19): 7642-53. 4Gritti A, Parati EA, Cova L, et al. Multipotential stem cells from the mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J neurosci, 1996; 16(3): 1091-1100.,THANK YOU,
