1、细胞培养基础知识,主要内容,1.细胞培养室的设置、设备和准备工作2.细胞培养用液及培养基3.细胞培养的基本技术,细胞培养室的设置,缓冲间,更衣间,操作间,紫外灯照射,每月对更衣间及操作间新洁尔灭擦拭地面、75%乙醇擦拭台面的方式进行消毒,细胞培养室的设备,超净工作台 CO2培养箱： 5 % CO2 ，T 36.50.5 倒置显微镜 蒸汽压力灭菌锅 液氮罐 电热干燥箱 离心机、天平、磁力搅拌器 酸缸、滤器 移液器、耗材,超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃及细菌，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,超净工作台的使用,使用
2、前开启柜内紫外灯照射2030分钟；开启风机,关闭紫外灯后预工作25分钟，以除去臭氧和使工作台面、空间呈净化状态工作过程中注意要一直开着风机使用完毕后要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净（切不可擦拭有机玻璃面板），开启紫外灯，关闭风机,超净台台面的摆放,猪头,酒精灯,操作区,移液枪架,培养液A,B,C,离心管架,废液缸,杂物,杂物,吸管筒,细胞瓶,杂物,棉球,枪头盒,枪头盒,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为36.50.5, 5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气保持培养箱内空气干净定期消毒(75%乙醇擦拭)箱内水盘中放入无菌蒸
3、馏水(CuSO4饱和) 保持箱内湿度，避兔培养液蒸发,倒置显微镜,使用注意：及时关闭显微镜(灯泡过热易烧坏),蒸汽压力灭菌锅,湿热消毒：15磅，维持20-30分钟。消毒前常用的包装材料：纱布、报纸、铝饭盒,液氮罐,定期检测，发现挥发至一半时及时补充补加液氮时做好眼、手、脚等身体暴露位置的防护以免冻伤,电热干燥箱,烘干后及时取出物品温度设置要合理，塑料制品烘干温度不超过80,离心机、天平、磁力搅拌器,冷冻高速离心机,普通低速离心机,离心机、天平、磁力搅拌器,磁力搅拌器,电子天平,酸缸、滤器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,移液器,量程：0.22 ul、110 u
4、l、 220 ul、550 ul、 10100 ul、20200ul、 1001000 ul设置量程 手柄的显示窗可清楚地显示移液器所移液量。移液量通过顺时针或逆时针旋转操作按钮来设置(仅对可调移液器),移液器的使用,移液器的使用,吸头安装容量设定吸液放液卸去吸头 1.轻轻用力下压的同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转180度，不可采取剁吸头的方式 2.从大值调整到小值时，刚好就行;但从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回3.先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面(几毫米),平稳松开按钮4.慢慢压下按钮至第一段，停一秒再压至第二段，把溶液完全压出,A. 保持微移液器垂直
5、，将按钮压至第一段；B. 微移液器头尖端浸入溶液，缓慢释放按钮；C. 保持微移液器垂直，将微移液器头与容器壁接触，慢慢压下按钮至第一段；D. 压至第二段把溶液完全释放出；E. 释放按钮回原。,移液器使用注意,1.使用完毕后，及时将量程旋回2.移液器按钮有两档，第一档为使用档(正常吸取液体)，第二档为释放液体档(将枪头内剩余液体吹出)3.请勿将体积调整圈转到超过量程最高或最低的使用范围4.释放按钮不可太快，以免溶液冲入吸管柱而腐蚀活塞5. 移液器任何部分切勿用火烧烤，也不可吸取超过70的溶液6.卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染,耗材,细胞培养瓶,25ml、50ml、100ml、2
6、50ml玻璃培养瓶,10cm、25cm、75cm塑料培养瓶,耗材,细胞培养板 6孔 12孔 24孔 48孔 96孔,耗材,细胞培养皿35mm 60mm 100mm,耗材,冻存管 1.2ml 2ml 5ml,耗材,离心管(10ml、50ml),EP管(1、1.5、2ml),准备工作,在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。,准备工作,【洗手和着装】原则上和外科手术相同。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实
7、验过程中手触及可能污染的物品和出入超净台及培养室都要重新用消毒液洗手。,准备工作,在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。,准备工作灭菌,物理方法：物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等物理除菌：过滤(0.1微米、0.22微米、0.45微米)、离心沉淀等； 化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）,准备工
8、作灭菌,常用的灭菌方法：1.高温高压灭菌（湿热法）：灭菌锅底部加入适量自来水，导气管伸至罐底并防止堵塞。在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后灭菌锅内的残留冷空气排出。冷空气排出后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。,准备工作灭菌,根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品(如布类、金属器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20min，一些常规使用的液体(PBS等)的消毒要求为15磅15min。消毒完毕后一定要先打开阀门放气，再打开消毒器的盖，以免发生意外。,准备工作灭菌,2.紫外线灭菌：紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间
9、里的空气、操作台表面及桌椅等灭菌。 也可以用紫外线消毒一些塑料培养器皿（如塑料培养皿、塑料培养板等）。,准备工作灭菌,3.过滤除菌消毒合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等不能用高压灭菌的方法进行灭菌，可采用过滤方法除菌。4.抗生素除菌常用的抗菌素为青霉素和链霉素，加入到培养基中主要是起预防作用。,准备工作清洗,在细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 瓶盖、胶塞的清洗 塑料制品的清洗,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不残留任何物质,浸泡：清水浸泡，可使
10、附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，生产及运输中，玻璃表面带有大量干固的灰尘，表面呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜以中和碱性物质再次使用的玻璃器皿，常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有气泡或浮在液面上,刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质(专用软毛刷) 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,浸酸 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质； 浸泡时器皿要充满清洁液； 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时。,清洁液，常用三种：强清洁液，次强清洗液，弱清洁液,
11、清洁液的配制配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中先使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发。配成后清洁液一般为棕红色，溶液变色至绿色时表明清洁液失效,冲洗刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗，不留污染或清洁液的残迹流水冲洗十次以上，每次水须灌满荡洗后倒净，最后用蒸馏水清洗3-5次，烘干备用,瓶盖、胶塞的清洗,新购置的细胞瓶盖里软胶带有大量滑石粉及杂质，去除后，以自来水冲洗，浸泡5%稀盐酸过夜，再做常规清洗。 常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，自来水冲洗，蒸馏水冲洗 3-5次，烘干备用,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用
12、无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时先用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，蒸馏水洗1-2次，烘干后再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，烘干备用 其中塑料培养板、塑料培养皿及塑料培养瓶均按玻璃制品清洗方法清洗,滤器清洗用软毛刷刷洗，流水冲洗，蒸馏水浸泡过夜，烘干备用。,清洗注意事项：,及时将烘箱中烘干物品拿出，以便于他人放置需烘物品 烘箱温度一般不超过65 ，如有特殊需要，使用完毕后请将温度调回原温度 普通浸泡时，浸泡时间不宜过长，清洗后及时浸泡酸液 浸泡酸液时，记录个人所泡物品清单，清洗后以供使用 清洗完成后，及时将物品收至相应位
13、置。,细胞培养用液及培养基,水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 培养基,细胞培养用液,水：新鲜配置的蒸馏水或去离子水细胞在体外培养时对水的质量非常敏感，普通自来水含有大量离子及其他杂质，对细胞生长不利。蒸馏水不宜储存时间过久，且应尽量减少与外界的接触。,细胞培养用液,平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液用途如下：a.配制各种试液：如配“胰酶”消化液。 b.用于洗涤组织和细胞。,为了便于保存和减少有关成分的化学反应，平衡液可配成20 、10 和 5 浓缩液的储存液(母液)。,细胞培养用液,PH调节液碳酸氢钠液、1N的盐酸溶液HEPES缓冲液是一种氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒
14、定的pH范围。通常使用浓度为1015mM，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。,细胞培养用液,消化液胰蛋白酶溶液EDTA溶液 胶原酶溶液,细胞培养用液,胰蛋白酶主要作用：水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。常用浓度：0.25%用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制(PH8,温度37 ，作用力最强)，用滤器过滤除菌。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。,细胞培养用液,EDTA溶液作用机制：通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子，从而破坏细胞间的连接。使用浓度
15、：0.02%，配制时应加碱助溶。 EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。,细胞培养用液,培养基：分天然培养基和合成培养基天然培养基：血清血浆组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）,细胞培养用液,血清：常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。优质血清的标准透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌,逐步解冻法20 或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用20 ml无菌血清瓶分装10-15 ml。勿直接由20至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质
16、凝结而发生沉淀。,血清解冻方法,细胞培养用液,合成培养基根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。,细胞培养用液,人工合成培养基有干粉型、1倍工作液型和10倍浓缩型。常用的干粉型培养基性质稳定，便于储存和运输，使用方便。使用时按照说明书要求配制，要确保营养液所有组分完全溶解，并在消毒和保存过程中不产生沉淀。,完全培养基的组成,人工合成培养基 8095 血清 520 碳酸氢钠 1.0 2.0 g/L 青、链霉素 各100Uml,
17、细胞培养用液,下面以RPMI-1640培养液为例，简介配制方法 RPMI-1640基础培养液RPMI-1640 1袋, NaHCO3 2.0 g, 青霉素0.06g，链霉素0.1g, 蒸馏水 700ml, 磁力搅拌至颗粒完全溶解(34h)。 加水至终体积1000ml，容量瓶定量，滤过除菌，分装，抽样做无菌试验，4储存。RPMI-1640血清细胞培养液RPMI-1640基础营养液 8090ml, 加小牛血清 1020ml，pH 7.1 7.2 。,细胞培养的基本技术,培养细胞的生长方式及类型 细胞培养过程(复苏、传代、冻存)细胞计数其他方面,培养细胞的生长方式及类型, 贴附生长型细胞必须贴附于底
18、物才能生长的细胞。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长型细胞不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞 (三) 半悬浮细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢。,贴壁细胞,每代贴壁细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,游离期悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期贴附底物(胶原、玻璃、塑料、其它细胞等)，一般24小时内贴壁。 潜伏期此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。,悬浮生长型细胞,来源：血，脾
19、或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞 特点：在悬浮中生长良好的细胞，圆形 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便，易于收 获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正 常细胞),细胞培养过程,复苏 传代冻存,细胞培养过程复苏,(1)从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（快融、1分钟左右）； (2)5分钟内将冻存管内细胞悬液吸入离心管，加 入510ml培养基； (3)低速离心510分钟； (4)去上清(除去DMSO)，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞培养过程传代,概念：培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大，导致营养枯竭，会影
20、响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,细胞培养过程传代,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1. 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2. 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3. 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液为0.25的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法,1 倒去培养瓶中的培养液 2 PBS 1-2
21、ml洗一次 3 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准),静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 4 加入含血清的培养液。 5 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 6 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。 7 吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 8 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 9 将细胞瓶放入培养箱中培养。,传代注意事项,接种数量为51048105个/ml。 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细
22、胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,细胞培养过程冻存,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,细胞培养过程冻存,原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 重结晶在0 发生，因此速融的最主要目的是让细胞迅速地通过0 危险期,慢冻程序,4 30 分钟20 30 分钟80 16 -
23、 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存冷冻管内细胞数目一般为1106 细胞/ml 常用细胞冷冻保存液5%或10DMSO（二甲基亚砜）完全培养液,细胞计数,培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml(4大格细胞总数/4)104个细胞/ml 注意： 镜下偶见由两个以上
24、细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,其他方面细胞培养的污染和检测,细胞培养常见的污染最常见的有：大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、白色葡萄球菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,其他方面细胞培养的污染和检测,污染源 无菌操作技术不当操作室环境不佳污染之血清污染之培养液,白色念珠菌污染,真菌感染,其他方面细胞培养的污染和检测,染菌后的处理： 细胞不重要：丢弃细胞及所用培养液 重要：如细菌污染，加大抗生素用量；真菌污染，使用两性霉素处理；霉菌污染，如果细胞生长
25、良好，有限稀释,其他方面细胞运输,随身携带 0.51小时，正常量培养基 1小时3天，加满培养液密封 邮寄 特快专递，加满培养液密封,其他方面注意点,将工作中培养箱的门长时间开放 培养箱内没有水盘 细胞长时间进行观察 一天看几次（用显微镜） 顺序：观察细胞将细胞放于超净台准备培养液，烧枪头操作细胞 用酒精棉消毒培养瓶口后马上灼烧 在用的枪头碰到酒精灯芯后继续用,其他方面注意点,手指不能触及器材使用端，触及后需更换或灼烧后使用（如瓶口），不要在打开的容器正上方操作实验。 使用后的枪头不能再用火焰消毒，枪头中残留培养液被烧焦碳化带入培养基中会毒害细胞 瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒 离开超净台时，先开启紫外，关闭操作窗口，再关闭风机，避免室内细菌随空气流入超净台 避免戴手套接触生活区物品（开门、关门等）,谢谢！,
