1、第 卷第 期 环 境 科 学 Vol. , No. 年 月 ENVIRONMENTAL SCIENCE地表水体中叶绿素 a 提取方法比较研究王金丽 1，颜秀勤 1，宁 冰 1，尚 勇 2，景文东 2（1. 国家城市给水排水工程技术研究中心，天津 300074 2. 廊坊市龙源环城水系生态恢复有限责任公司，廊坊 065000）摘要：以水和废水监测分析方法中叶绿素 a 测定所采用的丙酮提取法为标准方法，研究对比了该法与多种改进方法对水体中叶绿素 a 的提取效果。结果显示，丙酮- 不研磨-延时提取叶绿素 a 的方法与标准法的拟合度最好。针对雨污水补给天然河道、浅层地下水补给景观河道以及人工池塘等不同
2、水体，分别研究了丙酮-不研磨- 延时法提取叶绿素 a 的准确度和可信度，结果表明该法与标准法的叶绿素 a 测定结果无显著性差异，而操作更简便，精密度更高，对操作人员的身体伤害小。因此可用丙酮-不研磨- 延时法代替标准法测定地表水体中的叶绿素 a。关键词：叶绿素 a；丙酮- 不研磨-延时法；地表水体中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：Comparison of Methods to Extract Chlorophyll a in Surface WatersWANG Jin-li1, YAN Xiu-qin1, NING Bing1, SHANG Yong2, JING Wen-dong2
3、(1. National Engineering Research Center for Water and Wastewater, Tianjin 300074, China; 2. Ecological Restoration of Rivers around the City of Langfang, Co., Ltd, Langfang 065000, China)Abstract: With the acetone extraction on the book of water and wastewater quality detection and analysis method
4、as standard method, this paper compared the effect of standard and all improved methods on the extraction of chlorophyll a in surface waters. The results showed that, the fitting degree of acetone-no grinding-delayed method and standard method was the highest. Consequently, in order to analyze its a
5、ccuracy, precision and reliability, acetone-no grinding-delayed method was applied to extract chlorophyll a in three different kinds of surface water, natural river supplied by rain and wastewater, landscape river and artificial pond supplied by shallow groundwater. The results demonstrated that, th
6、is method had no significant difference with standard method, furthermore, it was easier in operation, with better precision, and had smaller harm to operator. So, it could take the place of standard method to determine chlorophyll a in surface waters.Key words: chlorophyll a; acetone-no grinding-de
7、layed method; surface waters叶绿素 a（Chl-a）常用作水体初级生产力的衡量指标。在实践中，常通过测定 Chl-a 的含量来了解水体富营养化的程度，以便采取有效的监控和治理措施。由于水和废水监测分析方法中叶绿素 a 测定的标准方法存在一定的缺陷，如研磨转移等会造成样品损失，影响测定第 卷第 期 环 境 科 学 Vol. , No. 年 月 ENVIRONMENTAL SCIENCE结果的准确性；滤膜冷冻干燥 6-8h，再经研磨、90%丙酮提取和离心等操作，耗时较长，特别收稿日期：2010- ； 修订日期：基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项，廊坊市非常规水
8、源城市景观水系利用技术集成与综合示范课题（2008ZX07314-007 ）作者简介：王金丽（1983） ，女，硕士，E-mail: 环 境 科 学 卷是在样品数量较多的情况下，难以在正常的工作时间内完成分析测试工作，因此许多学者纷纷探求更为精确、有效、简便的测定方法。目前对测定方法的研究主要有：以 90%丙酮为提取剂的延时提取法 1、不研磨浸提法 2-3、热丙酮法 4；以 90%乙醇为提取剂的不研磨浸提法 5、热乙醇法 6和混合溶剂提取法 7-8。本文研究对比了包括标准方法在内的 12 种方法提取 Chl-a的效果，从中筛选出测定结果准确性好，精密度高，操作简便的方法并进行可信度验证，为地表
9、水中 Chl-a 的测定提供其它可供选择的参考方法。1 材料与方法1.1 水样及采集所有测定水样均取自廊坊市城区内水体。12 种方法对比实验所用水样采自以再生水为主要补给水源的景观河道廊坊市八干渠。后期不同水源影响研究中的水样分别采自人工池塘、以浅层地下水为主要补给水源的景观河道大皮营引渠和以雨污水为补给水源的天然河道龙河。水样均取自水面下 20cm 处，取样后当天监测。1.2 材料主要仪器设备：高输出真空泵，离心机，恒温水浴锅，冰箱，DR5000 分光光度计。主要试剂：90%丙酮，90%乙醇。其他材料：混合纤维素酯微孔滤膜（0.45m） ，研钵，抽滤瓶，具塞刻度离心管（10mL ） ，锡箔纸
10、，具塞刻度试管（10mL ） ，1cm 石英比色皿。1.3 实验方法方法 1：标准法， 水和废水监测分析方法（第四版）中叶绿素 a 测定的丙酮提取法 9；方法 2：乙醇法，将标准方法中的 90%丙酮换为 90%乙醇，其余操作与标准法相同；方法 3：丙酮-不研磨，取消标准法中的研磨操作步骤，其余操作与标准法相同；方法 4：乙醇-不研磨，将方法 3 中的 90%丙酮换为 90%乙醇，其余操作与方法 3 相同；方法 5：丙酮-延时提取，滤膜不冷冻干燥，水样抽滤后，滤膜剪碎用 90%丙酮手动研磨萃取，在冰箱内于 4冷藏避光提取 16-20h，取出后离心、测定等操作与标准法相同； 方法 6：乙醇-延时提
11、取，将方法 5 中的 90%丙酮换为 90%乙醇，其余操作与方法 5 相同；方法 7：丙酮-不研磨-延时提取，取消方法5 中的研磨操作，其余操作与方法 5 相同；方法 8：乙醇-不研磨-延时提取，将方法 7中的 90%丙酮换为 90%乙醇，其余操作与方法7 相同；方法 9：热丙酮，水样过滤后，滤膜内向折叠后放入 10mL 刻度离心管，冷冻 6-8h 后，取出后迅速向离心管中加入 5mL 90%热丙酮（50） ，水浴加热 2min，水浴温度为 50，而后在室温下避光提取 4h4，之后的离心、定容、测定等步骤与标准方法相同；方法 10：热乙醇，将方法 9 中的 90%丙酮换为 90%乙醇，90%乙
12、醇加热温度及提取液水浴温度均为 80 6，其余操作与方法 9 相同；方法 11：不冷冻-热丙酮，取消方法 9 中滤膜的冷冻干燥步骤，其余操作与方法 9 相同；方法 12：不冷冻-热乙醇，将方法 11 中的90%丙酮换为 90%乙醇，90% 乙醇加热温度及提取液水浴温度均为 80，其余操作与方法11 相同。2 实验结果与分析2.1 不同方法的对比结果用 12 种不同的方法对具有代表性的再生环 境 科 学 卷水补给河道的水样进行单因子重复水平实验，提期 王金丽等：地表水体中叶绿素 a 提取方法比较研究 取水中的 Chl-a，并用三色法测定吸光度，进而计算出 Chl-a 的值。其中第一批实验比较研究
13、了标准法与是否研磨、延时等条件的提取效果，其结果见表 1；第二批实验水样取自与第一批水样相同的水体，取样时间不同，对比了标准法与冷冻和不冷冻的情况下热法提取 Chl-a 的效果，其结果见表 2。表 1 显示，采用三色法测定 Chl-a 时，在其他条件相同的情况下，90% 丙酮提取 Chl-a的效果明显好于 90%乙醇。就丙酮提取而言，与标准法相比，丙酮-不研磨 -延时法提取得到的 Chl-a 均值稍大，而且标准方差和变异系数均小于标准法，表明其精确度较高；丙酮-不研磨法的效果较标准法稍差，但好于丙酮延时法。就乙醇提取而言，乙醇法稍好于乙醇-不研磨-延时法，后者又好于乙醇延时法，乙醇延时法的提取
14、效果又明显好于乙醇-不研磨法。这表明研磨转移等操作步骤会造成样品的损失，但不研磨又要保证有足够的提取时间才能使 Chl-a被充分提取出来。因此需要在不研磨与延长提取时间中找到一个合适的平衡点，以达到最优提取效果。而本实验中丙酮-不研磨- 延时法可以满足该平衡点的要求。表 1 是否研磨/延时条件下测定结果比较Table 1 Results comparison of Chl-a extracted by grinding/delayed or not测定方法 平行测定结果/ mgm -3 均值 / mgm-3标准方差 变异系数/ %标准法 92.76 85.99 84.82 96.8 90.09
15、 4.92 5.46乙醇法 58.16 48.30 54.87 43.86 51.30 5.57 10.86丙酮-不研磨法 81.75 85.20 71.70 85.98 81.16 5.68 7.01乙醇-不研磨法 29.77 30.73 34.96 27.44 30.73 2.72 8.85丙酮延时法 76.13 73.80 83.44 63.74 74.28 7.05 9.49乙醇延时法 37.42 52.34 42.5 49.26 45.38 5.81 12.80丙酮 -不研磨-延时法 91.37 95.62 91.38 91.38 92.44 1.84 1.99乙醇 -不研磨-延时法
16、 55.07 41.94 56.23 46.17 49.85 6.00 12.04由表 2 可见，热丙酮法的效果优于热乙醇法，但二者提取 Chl-a 的效果差异明显小于表1 中的结果。以标准法为基准，表 1 中乙醇的最大提取效率仅为 56.94%（即 51.30/90.09） ，而热法中热乙醇法的提取效率可达 79.62%（即83.05/104.31） ，说明加热法对于提升乙醇提取表 2 是否冷冻条件下热法提取测定结果比较 Table 2 Results comparison of Chl-a extracted by hot solvent/ freezing or no-freezing测
17、定方法 平行测定结果/ mgm -3均值 / mgm-3标准方差 变异系数/ %标准法 100.96 108.38 105.48 102.4 104.31 2.86 2.75热丙酮法 104.94 103.99 104.73 102.61 104.07 0.91 0.87热乙醇法 85.80 80.00 87.17 79.24 83.05 3.48 4.19不冷冻-热丙酮法 102.39 100.07 97.94 97.94 99.59 1.84 1.85不冷冻-热乙醇法 81.55 86.00 78.27 82.51 82.08 2.75 3.35环 境 科 学 卷Chl-a 的效果明显。热
18、丙酮法的均值与标准法相近，标准方差和变异系数均明显小于标准法，分别为 0.91 和 0.87，具有较好的准确性和精密度。通过比较水样抽滤后滤膜冷冻与不冷冻两种情况下 Chl-a 的提取效果显示，热乙醇提取中，无论滤膜冷冻与否测定结果的均值差别不大，而热丙酮提取中，冷冻后的提取效果稍好。通过上述对比分析研究可知：标准法的冷冻、研磨等步骤操作繁琐，对操作者身体伤害较大，时间不合理；与标准法相比，热丙酮法的提取效率和结果的准确性较高，然而滤膜经6-8h 冷冻、热法水浴和室温避光提取 4h，同样存在无法在工作时间内完成测试工作的缺点；而丙酮- 不研磨-延时法准确性好、精密度较高，且无需研磨，使操作人员
19、直接接触丙酮的时间大大减少，减轻了对操作者的身体伤害，样品避光冷藏过夜提取 16-20h，操作简单，便于处理和测试多个样品。因此后续实验中进一步研究了丙酮-不研磨-延时法对不同地表水中 Chl-a的提取效果，对其有效性进行验证。2.2 丙酮-不研磨 -延时法对不同水质中 Chl-a的提取效果为了验证丙酮-不研磨-延时法提取 Chl-a 的适用性和可信度，分别以种植有水生植物的人工池塘和以浅层地下水为主要补给水源的景观河道大皮营引渠以及以雨污水为主要补给水源的天然河道龙河等不同本底水质水体为研究对象，进行丙酮-不研磨-延时法与标准法的精密度对照实验，结果见表 3。对于三种不同地表水的水样，丙酮-
20、不研磨-延时法与标准法提取Chl-a 的均值均非常接近，前者测定结果的标准方差和变异系数（标准偏差）明显小于后者，说明丙酮- 不研磨-延时法的精密度较高。表 3 不同水质条件下丙酮-不研磨-延时法与标准法提取 Chl-a 的结果比较Table 3 Results comparison of Chl-a extracted from different quality water by acetone-no grinding-delayed method and standard method水样 测定方法 平行测定结果/ mgm -3均值/ mgm-3标准方差变异系数/ %标准法 23.6 2
21、2.2 22.73 23.31 21.02 20.14 22.17 1.23 5.56人工池塘丙酮-不研磨-延时法21.08 22.48 22.48 22.54 21.72 23.07 22.23 0.65 2.91标准法 92.45 96.89 101.33 98.07 95.36 91.25 95.89 3.39 3.54景观河道丙酮-不研磨-延时法98.24 95.92 94.75 93.80 98.24 97.08 96.34 1.68 1.74标准法 208.16 215.36 214.86 225.66 210.90 207.81 213.79 6.06 2.83天然河道丙酮-不研
22、磨-延时法209.84 208.14 217.03 219.86 217.52 216.11 214.75 4.26 1.98以标准方法测定结果的平均值为对照，对三种水样采用丙酮-不研磨-延时法的测定结果进行 t 检验（表 4） ，以判定二者间有无显著差异。计算得 t 值分别为 0.21， 0.60，0.50，均小于给定显著水平 =0.20 下的 t 分布临界值 t/2 (5)= t0.10(5)=1.476，说明丙酮-不研磨-延时法与标准法测定的 Chl-a 结果之间不存在显著性差异。因此可以用操作较为简便，精密度较高的丙酮-不研磨-延时法代替标准法作为地表水体中 Chl-a 的测定方法。期
23、 王金丽等：地表水体中叶绿素 a 提取方法比较研究 表 4 丙酮-不研磨-延时法与标准法测定结果的 t 检验结果Table 4 T -test of the results determined by acetone-no grinding-delayed method and standard method 水样 测定方法 自由度 t 值标准法人工池塘丙酮-不研磨- 延时法5 0.21标准法景观河道丙酮-不研磨- 延时法5 0.60标准法天然河道丙酮-不研磨- 延时法5 0.503 结论通过上述实验研究，得出叶绿素 a 提取方法的几点结论如下：（1）就 Chl-a 提取剂选择而言，在其他条件
24、相同的情况下，90%丙酮的提取效果明显优于 90%乙醇；（2）就是否研磨与提取时间而言，不研磨可以减少样品的损失，但需要保证足够的提取时间，一般在 16-20h 为宜；（3）热法可以明显提高 Chl-a 的提取效率，但需要合理控制加热温度和时间，并保证加热过程中避光操作，对操作条件要求严格；（4）滤膜冷冻与否，对热法提取 Chl-a 有一定的影响，不冷冻会使测定结果稍小，但影响不大；（5）热丙酮法和丙酮-不研磨 -延时法与标准方法相比，提取得到 Chl-a 的量接近，并且标准方差和变异系数均较标准法小，精密度高。但丙酮加热法条件控制较难，而且用时范围为10-12h，不方便操作；而丙酮 -不研磨
25、-延时法无需研磨，操作简单，对身体伤害小，过夜提取 16-20h，时间上较合理，便于同时测定多个样品；（6）丙酮-不研磨-延时法与标准法测定Chl-a 的结果无显著性差异，且丙酮-不研磨- 延时法的精密度要高于标准法，因此用该法测定地表水体中的 Chl-a 具有较强的可靠性和准确性，可替代标准法。参考文献1 韩桂春, 谷丰, 张忠臣. 淡水中叶绿素 a 测定方法的探讨 J. 中国环境监测, 2005, 21(1): 55-57. 2 林少君, 贺立静, 黄沛生 等. 浮游植物中叶绿素 a 提取方法的比较与改进 J. 生态科学, 2005, 24(1): 9-11.3 唐曙暇. 改进淡水中叶绿素
26、 a 测定方法的探讨 J. 江淮水利科技, 2006, 5: 40-41.4 吴志旭, 张雅燕. 叶绿素 a 测定方法的改进及最优提取时间探讨 J. 甘肃环境研究与监测, 2003, 16(2): 150-152.5 张如美, 孙晓斌. 对叶绿素 a 测定方法的改进 J. 环境监测管理与技术, 2002, 14(2): 31.6 陈宇炜, 高锡云. 浮游植物叶绿素 a 含量测定方法的比较测定 J. 湖泊科学, 2000, 12(2): 185-188.7 洪法水, 魏正贵 , 赵贵文. 菠菜叶绿素的浸提和协同萃取反应 J. 2001, 18(7): 532-535.8 杨敏文. 快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨 J. 光谱实验室, 2002, 19(4): 478-481.9 国家环境保护总局. 水和废水监测分析方法（第四版）M. 北京: 中国环境出版社, 2002: 670. 10 吴梅村. 数理统计学基本原理和方法 M. 成都: 西南财经大学出版社, 2006. 11 谢衷洁 . 普通统计学 M. 北京: 北京大学出版社, 2004.
