1、基因工程制药技术,马文鑫、李俊、金增辉、王婷婷、刘洋、彭晶、宋川,基因工程制药概述,基因工程药物是指利用重组DNA技术，将生物体内生理活性物质在细菌,酵母，动物细胞或转基因植物中大量表达生产的新型药物。,内源生理活性物质,由于材料来源困难或技术问题而无法研究出来，即使应用传统方法从动物脏器中提取出来，也因造价太高而使患者望而却步。即使用得起，亦因来源有限而供不应求。由于由于免疫原性，在使用上受限制。提取中可能受污染，对患者造成严重危害。,基因技术生产药物的优点,可大量生产过去难以获得的生理活性物质。可对生理活性物质进行深入研究。利用基因制药技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,基因工程制药
2、的历史,人类基因工程走过的主要历程怎样呢？1866年，奥地利遗传学家孟德尔神父发现生物的遗传基因规律；1868年，瑞士生物学家弗里德里希发现细胞核内存有酸性和蛋白质两个部分。酸性部分就是后来的所谓的DNA；1882年，德国胚胎学家瓦尔特弗莱明在研究蝾螈细胞时发现细胞核内的包含有大量的分裂的线状物体，也就是后来的染色体；1944年，美国科研人员证明DNA是大多数有机体的遗传原料，而不是蛋白质；1953年，美国生化学家华森和英国物理学家克里克宣布他们发现了DNA的双螺旋结果，奠下了基因工程的基础；1980年，第一只经过基因改造的老鼠诞生；1996年，第一只克隆羊诞生；1999年，美国科学家破解了人
3、类第 22组基因排序列图；未来的计划是可以根据基因图有针对性地对有关病症下药。,克隆羊,基因工程药物制造步骤,上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。下游阶段：将实验成果产业化，商业化。包括工程菌大规模发酵最佳参数确定，新型反应器的研究，高效分离介质及装置的开发，生物传感器的开发，电子计算机的优化控制。,目的基因的获得方法,建立外源生物个体的的基因组文库，从文库中筛选目的基因。通过合成或PCR扩增所需目的基因。,PCR过程,构建DNA重组体,基因表达,常用的宿主菌有:原核生物 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌真核生物 酵母 丝状真菌 哺乳动物细胞 COS和CHO.,啤酒酵母,链霉菌属
4、,基因工程菌中试,一 工程菌的选择具备的条件：能用一般基因重组技术获得，有高产潜能，能以工业原料为培养基，生产工艺采用一般工业生产经验，能产生和分泌蛋白质，无毒性，符合国家卫生部门有关规定，代谢能控制，产品有特异性。,基因工程菌中试,二 反应器的设计发酵罐设计应符合生物反应与化学工程需要。实验室多采用小型罐，罐身附有各种传感器，能收集各种参数。三 发酵培养基的组成提供化学元素 提供能源，促进菌体生长与产物合成。控制代谢，诱导菌种改变生长速率或代谢途径以增加产量。,基因工程菌中试,四 工艺最佳化与参数检测控制工艺最佳化：指最快周期 ，最高产量，最好质量，最低消耗，最大安全周期，最周全的废物处理效
5、果等。参数检测控制：主要参数，生物量，碳源，产品。,重组菌的培养,一 基因工程菌的培养方式分批培养补料分批培养连续培养透析培养固定化培养,基因工程菌的培养设备,3.5升发酵罐,30升发酵罐,影响发酵的因素,培养基 对培养基中营养源的种类和含量要求较高；优化碳源 氮源以及微量元素和无机盐。溶氧浓度 发酵过程中保持适宜的通氧浓度，必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。PH 稳定的PH是菌体生长的必要条件。PH的改变会影响细胞生长和基因产物的表达。温度 较高温度有利于细菌生长，提高菌体的生物量；但温度过高会抑制菌体生长和外源蛋白的表达。,基因工程药物的分离纯化,基因工程药物的特点目的产物在初始物料中含量
6、低含目的产物的初始物料组分复杂目的产物稳定性比较差种类繁多对其质量 纯度要求高，甚至要求无菌 无热源等。,分离纯化的步骤,细胞粉碎固液分离浓缩与初步分离高度纯化直至得到纯品成品加工,细胞粉碎,物理粉碎法：高压匀浆法， 高速珠磨法， 超生破碎法，高压挤压法。化学破碎法：渗透冲击，增溶法，脂溶法生物破碎法：酶溶法,高压匀浆机,超声波破碎机,固液分离,离心沉淀：高速离心和超速离心膜过滤：微滤 超滤和反渗透双水相萃取,台式高速离心机,重组蛋白质的分离纯化,分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是具有多种多样的分离机制，设备简单，便于自动化控制和分离过程中
7、无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱，疏水色谱，反相色谱，亲和色谱，凝胶过滤色谱及高压液相色谱。,亲和层析装置,产品质量保证要点,产品安全性评价：临床试验产品本身的结构：药理学 毒理学研究严格控制条件：从原料到制成品制备过程的每一步都须严格控制与鉴定质量，确保符合标准规格，安全有效。,生理活性鉴定,体内生物活性测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型，体外生物活性测定方法：细胞培养计数法，酶法细胞计数法。蛋白质的比活性：每毫克蛋白质的生物学活性。不仅是含量指标，也是纯度指标。,蛋白质含量测定：Folin-酚试剂法，双缩脲法，紫外吸收法，凯氏定氮法等方法。蛋白质纯度分析：还原性和非还原性SDS-PAGE,等电点聚集等。,产品的保存,目的产物失活受多种理化因素的影响，保存时要根据不同的特性，采取不同的措施，防止变性降解。液态保存：1 低温保存：液态蛋白质样品在零下二十至零下十度保存。2 在稳定PH条件下保存：蛋白质较稳定的PH一般在等电点附近3 高浓度保存4 加保护剂保存：糖类 脂肪类 蛋白质类 及有机溶剂。,产品的保存,固态保存固态蛋白质比液态稳定。一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定。长期保存蛋白质的最好方法：制成干粉或结晶。,谢谢观看,
